以粗甘油发酵制备EPA研究

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本文作者：孔秀梅吴蕾作者单位：天津市食品生物技术重点实验室

由于人体不能自行合成EPA，只能从食物中摄取。鱼油特别是深海鱼油是EPA的主要来源，但从鱼油中提取的EPA胆固醇含量高，带有腥味，极大地影响了产品的品质。并且鱼油中EPA的构成和含量随着鱼的种类、季节、地理位置等不同而变化，以鱼油为原料具有不稳定的弊端[1]。因此，EPA的生产逐渐向利用微生物发酵合成方向发展。研究表明，利用真菌合成的EPA含量高，脂肪酸组成简单，纯化容易，并且没有鱼的腥味，合成周期短，有利于进行大规模生产，满足人类日益增长的需求。另外，利用生物柴油副产物粗甘油发酵生产EPA[2]，可以解决其生产过剩问题[3-5]，合理利用资源，降低生物柴油的生产成本，提高其在行业的竞争力，为生物柴油行业的可持续发展提供了保障[6]。

1材料与方法

1.1材料与仪器

畸雌腐霉(Pythiumirregulare)：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；生物柴油副产物粗甘油(自制)葡萄糖、酵母膏；琼脂；甲醇；浓硫酸；氯仿；十七烷酸(C17:0)(内标物)等。HIRAYAMA高温蒸汽灭菌锅、哈雅玛高压灭菌锅；振荡培养箱：上海博迅实业有限公司；Scientz-50n冷冻干燥；SW-CJ-IF超净工作台：苏州净化设备有限公司；高速冷冻离心机：北京雷勃尔离心机有限公司；磁力加热搅拌器：天津市欧诺仪器仪表有限公司；GC-9A气相色谱仪：日本岛津公司。

1.2实验方法

1.2.1粗甘油制备

(1)称取催化剂0.64gNaOH，将其缓慢溶解到90mL无水甲醇中，由于甲醇有毒，所以在通风橱内搅拌均匀，形成醇钾或醇钠溶液，将醇钾或醇钠活性溶液倒入到500mL三口烧瓶中。(2)称取200g大豆油，倒入到500mL三口烧瓶中，控制在80℃，反应时间2h，反应过程中采用电机搅拌，并通冷凝水[7]。(3)反应完成后冷却静置分层，上层浅黄色半透明状液体为粗生物柴油，下层棕色液体即为生物柴油副产物粗甘油。(4)将粗甘油与蒸馏水按1:4的比例混匀，以降低粗甘油的黏性；用盐酸调pH至3，使甘油中的皂化物转变为游离脂肪酸；静置分层将游离脂肪酸从粗甘油溶液中分离出来。甲醇是低沸点物质，培养基在121℃、15min的灭菌条件下能将甲醇从中去除，因此不需要采用额外处理方法对甲醇进行去除。

1.2.2发酵生产epa

1.2.2.1接种液制备

琼脂板的制备：在水中加入20g/L葡萄糖，10g/L酵母膏并充分溶解，再加入1.5%(w/w)琼脂，调pH至6。将菌种涂布在琼脂板上，在25℃下培养5d，用蒸馏水清洗琼脂板，可用玻璃珠使孢子脱落，孢子的悬浮液即接种液[8]。

1.2.2.2培养基制备

(1)固体培养基：20g/L葡萄糖、10g/L酵母膏、15g/L琼脂糖，调pH至5.8~5.9，121℃下高温灭菌15min。(2)液体培养基：30~70g/L粗甘油，10g/L酵母膏，调pH至6.0~6.5，121℃下高温灭菌15min。

1.2.2.3菌种活化及摇瓶培养

(1)菌种活化：将菌种接种到灭菌后的装有100mL固体培养基的250mL锥形瓶中，25℃培养5d，待有菌丝长出后加入50mL无菌去离子水和若干灭菌玻璃珠，震荡摇匀，目的是为了将菌团中形成的孢子分散均匀利于下一步均匀接种。(2)发酵培养：50mL液体培养基装入到250mL锥形瓶中，接种量为1mL，于25℃下170r/min振荡培养[8]。

1.2.3分析方法

1.2.3.1生物量测定

冷冻干燥法测菌体干重，具体操作是将不同发酵时间的发酵液将菌体转移到预先称量的冷冻干燥管中，进行冷冻干燥。

1.3.3.2EPA含量测定

(1)脂肪酸甲酯化：称取20mg冷冻干燥菌体于具盖玻璃试管中，加入4mL甲醇、浓硫酸、氯仿(体积比：1.7:0.3:2.0)混合溶液，并加入1mg内标物，拧紧试管盖，90℃条件下水浴40min，放置冷却后加入1mL蒸馏水，摇晃30s，两相生成，下相即为脂肪酸甲酯，将其加入离心管中，加入适量无水Na2SO4，1000r/min离心8min，用移液管将液体取出置于试管中用于气相色谱分析。(2)气相色谱分析①气相色谱条件：色谱柱采用程序升温：100℃升至220℃，每秒升10℃，220℃时保留5min。②EPA的定性分析：以十七烷酸(C17:0)为内标[10]，在同一色谱条件下，以标准品色谱峰的保留时间与样品色谱峰的保留时间对照进行分析。③EPA的产量分析EPAyield(mg/L)=ms/(Vs×1000)(1)式中：ms为样品中EPA甲酯质量，g；Vs为取样体积，L。

2结果与讨论

2.1发酵时间对菌体生长的影响

以70g/L浓度的粗甘油为碳源，在25℃，pH6.0条件下测定培养基中细胞干重，得到菌体生长曲线如图1所示。Vs为取样体积，L。

2结果与讨论

2.1发酵时间对菌体生长的影响

以70g/L浓度的粗甘油为碳源，在25℃，pH6.0条件下测定培养基中细胞干重，得到菌体生长曲线如图1所示。实验结果表明，菌体生长至80h时细胞干重达到最大值，之后细胞干重下降。因为脂质积累时间通常是在菌体生长达到最大值之后，因此在实验中取培养5d后菌体进行测定。

2.2EPA气相色谱定量分析结果

以70g/L浓度的粗甘油为碳源，25℃，pH6.0条件下培养5d所得菌种按1.3.3所述实验方法处理后，气相色谱分析结果显示，出峰时间10.0、15.5、16.5min分别为十七烷酸甲酯(内标)、二十碳四烯酸甲酯(ARA甲酯)、二十碳五烯酸甲酯(EPA甲酯)，3种脂肪酸甲酯分离良好，并且其余组分不干扰测定，根据内标物与EPA甲酯峰面积即可计算得到EPA产量。

2.3不同温度对菌体生长及脂质积累的影响

在pH6.0，转速170r/min，粗甘油加入浓度70g/L的条件下，对温度在15~35℃范围内菌体生长情况及EPA产量进行比较，发酵5d后，结果如表1所示。15、20℃菌体均形成光滑紧密的球团，且EPA含量较低，而25℃时，菌体分散成小米粥状，且菌球直径较小，细胞干重最大，EPA产量最高[11]；培养温度在30、35℃时，菌体也分散生长，但细胞干重减小，EPA产量也较低。实验表明，低温不利于菌丝分散生长，温度过高也不利于EPA的积累，因此，25℃是畸雌腐结果表明，在pH5.4~6.4条件下菌体生长情况及EPA产量变化不大，菌体均能较好生长，EPA积累也相差不大，但由图可得较低pH值有利于菌丝中EPA积累。

2.5不同转速对菌体生长及脂质积累的影响

在25℃，pH6.0条件下，对转速在160~180r/霉培养的最适温度，此温度下有利于菌体生长和EPA积累。

2.4不同pH对菌体生长及脂质积累的影响

在25℃，转速170r/min条件下，对pH在5～7范围内菌体生长情况及EPA产量进行比较，发酵5d后，结果如表2所示。min范围内菌体生长情况及EPA产量进行比较，发酵5d后，结果如表3所示。实验表明，转速对于菌体生长和EPA积累影响较大。转速越高，菌体生长和EPA的累积越多。但是转速上升到180r/min后，菌体和EPA的量变化不大。因为该菌体形状为团块状，不利于发酵过程中的营养物质以及氧的传递，只靠提高转速不能很好解决传质问题。需要进一步改进发酵过程的混合方式。

2.6初始粗甘油浓度对菌体生长及脂质积累的影响

在25℃，pH6.0，转速170r/min条件下，对粗甘油加入浓度在20~90g/L范围内菌体生长情况及EPA产量进行比较，发酵5d后，结果如表4所示实验表明，碳源浓度对于菌体生长和EPA积累影响较大，在低浓度时，由于不能满足菌体生长所需碳源量，菌体不均匀分散，且细胞干重和EPA产量均较低。70g/L的粗甘油浓度最适宜菌体生长和EPA积累。

2.7以葡萄糖和废甘油为碳源条件下的菌体生长及脂质积累情况根据文献记载，葡萄糖为发酵生产EPA的较佳碳源。在25℃，pH6.0条件下，分别以70g/L浓度的葡萄糖和粗甘油为碳源，发酵5d后，结果如表5所示。实验表明，使用粗甘油为碳源可达到与葡萄糖为碳源发酵生产相似的生物量和EPA产量。因此可以用粗甘油代替葡萄糖作为发酵畸雌腐霉生产EPA的碳源。

3结论

论文在确定了EPA提取、检测方法后对畸雌腐霉摇瓶发酵生产EPA的过程进行了考察，确定了发酵生产EPA的较优条件。结论如下。(1)利用粗甘油为碳源可以得到与葡萄糖为碳源发酵畸雌腐霉生产EPA获得相似的产量，可以用粗甘油代替葡萄糖作为发酵畸雌腐霉生产EPA的碳源。

(2)菌体生长情况与EPA产量的关系：由实验结果知，畸雌腐霉属于凝集型菌。发酵过程中能形成菌球体，而菌体是否成球除了与是否为凝聚型菌有关外，还受培养条件：起始pH值，温度等培养条件的影响。实验中发现，培养时通气量也能影响菌球体形成，较低转速时形成较大菌球体，但受时间限制，没有能最终确认最佳转速。在利用粗甘油为碳源发酵畸雌腐霉生产EPA中，甘油浓度较低时菌体不能均匀分散；微酸性条件(pH5~6)菌丝能均匀分散，EPA含量较高，说明酸性环境有利于EPA的积累；温度较低时菌体形成球团，较高温度时能均匀分散。

(3)培养条件对畸雌腐霉生产EPA的影响：通过实验研究了以粗甘油为碳源的培养基和发酵操作条件对畸雌腐霉发酵生产EPA的影响规律。采用单因素实验的方式考察了粗甘油浓度、pH值、温度等因素对畸雌腐霉生长和EPA产量的影响。结果发现：最适的初始粗甘油浓度为70g/L，较好的通氧条件有利于菌体生长；发酵液初始pH为6.0；畸雌腐霉的最适生长温度是25℃。

(4)实验表明，粗甘油作为生物柴油工业生产过剩的副产物，可以利用于发酵畸雌腐霉生产EPA，不仅可以满足人们对于EPA日益增长的需要，还能解决合理利用废甘油，降低生物柴油产业生产成本，并保护环境。