牡蛎血浆蛋白特性探究

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本文作者：张泽高淑悦程继龙颜士慧李翀李玉婷张莉作者单位：山东大学海洋学院

近年来，随着海洋生物工程技术的运用，从海洋生物中获得活性成分成为开发高效、安全药物的重要资源，也是现代海洋科学研究的新热点[1]。海洋生物的种类繁多，例如贝类、腔肠动物、被囊动物、棘皮动物和微生物等。其中双壳贝类是其中很重要的一部分，它们在抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗疲劳和增强机体免疫力等方面均有良好的生物活性，是新型的创新药物、功能性和保健食品资源，是一类有巨大开发潜力的海洋生物。牡蛎俗称海蛎子，又称蚝，是世界上第一养殖贝类，也是我国四大养殖贝类之一。它营养丰富，蛋白质、多糖、牛磺酸、锌等营养素含量较高，具有很好的抗氧化抗衰老功效[2]。此外，XueQG[3]等在牡蛎的血浆中分离出一种溶菌酶，对革兰阳性菌和革兰阴性菌的生长均有抑制作用。又经RobertS.Anderson[4]等研究的结果表明，牡蛎的血浆有抗巨大芽孢杆菌的作用。至今，牡蛎活性成分的提取和开发已经是开发海洋资源的一个重要途径，虽然国内外对牡蛎的成分都进行了一些研究，但是尚有不足，对于牡蛎血浆及其纯化蛋白的抗氧化活性研究更是少见。本文中作者报告牡蛎血浆中一种活性蛋白的分离纯化及其抗氧化作用的研究，希望能为其开发成新型的海洋抗氧化药物提供一定的理论依据。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1太平洋牡蛎市售。

1.1.2主要试剂

硫酸铵(分析纯)、丙烯酰胺、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺、二苯代苦味酰自由基(DPPH)：Sigma公司；标准相对分子质量蛋白：上海博亚生物有限公司；考马斯亮蓝R250：上海生工生物工程有限公司；Tris：分析纯；SDS：BiomoI；柠檬酸三钠：分析纯；SephadexG-100：A.P.。

1.1.3主要仪器

TGLL218型冷冻离心机：太仓市医疗器材厂；层析柱：北京江晨宏伟生物科技有限责任公司，16mm×50cm；DYY2Ⅲ型稳压稳流电泳仪及电泳槽：北京市六一仪器厂；真空冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂有限公司。

1.2方法

1.2.1血浆的提取

本研究以血浆及其沉淀蛋白检测其基本抗氧化活性。用装配有1.5英寸22号针头的注射器插入牡蛎的闭壳肌静脉窦，抽取血液，然后迅速把抽取的血液推入到浸入冰水浴的洁净器皿中，之后将抽取的牡蛎血液在300g、10℃条件下离心10min以除去血细胞，取出上清液即为牡蛎血浆。

1.2.2原血浆的蛋白含量的测定

以考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，以牛血清白蛋白为对照制作标准曲线。

1.2.3抗氧化活性测定

抗氧化活性测定采用邻苯三酚自氧化法[5]。在比色管中分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL原血浆，加蒸馏水至1mL。加入Tris-HCl溶液(pH8.2)5.0mL和50mmol/L邻苯三酚溶液1mL，迅速摇匀，以蒸馏水为空白对照。每30s在325nm处测定吸光值。按下式计算清除率。清除率(%)=(F0-Fs)/F0×100(1)式中：F0为邻苯三酚的自氧化速率；Fs为加样品的反应溶液吸光值变化率。

1.2.4血浆粗蛋白的制备及其抗氧化活性测定

取血浆50mL移入放置于冰水浴中的小烧杯中，然后在搅拌下缓慢加入32.500g硫酸铵使溶液中硫酸铵的终浓度达到95%，静置30min后3000r/min离心20min，收集沉淀蛋白后脱盐处理，最后制备成冻干粉即为牡蛎血浆粗蛋白。称取牡蛎血浆粗蛋白100mg溶于10mL双蒸水中，配制成浓度为10mg/mL的蛋白液，测定抗氧化活性的方法仍采用1.2.3中的方法。

1.2.5血浆蛋白的分离纯化及抗氧化活性测定

将配置好的蛋白液上样到以pH6.5NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液充分平衡的SephadexG-100层析柱(1.6cm×50cm)进行层析，用平衡液进行洗脱，收集各个峰，脱盐，冷冻干燥备用。用双蒸水配制成1mg/mL的蛋白液，用1.2.3中方法测定各个峰的抗氧化活性从而确定活性峰。

1.2.6抗氧化蛋白的相对分子质量检测

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定，蛋白浓缩液(10、15μL)直接上样进行SDS-PAGE分析，分离胶浓度为15％，电泳条件：电压200V，90min，用0.5%考马斯亮蓝R250染色，使用不同相对分子质量的标准蛋白(10~260ku)对抗氧化蛋白进行相对分子质量及其分布测试及分析。

1.2.7纯化血浆蛋白抗氧化活性和热稳定性测定

1.2.7.1还原能力的测定[6]

在比色管中分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的样品，配制的样品浓度为1mg/mL，加蒸馏水至1mL。加入2.5mL的磷酸缓冲液(0.2mol/L，pH6.6)，再加入1%铁氰化钾2.5mL。混合物50℃水浴20min后加入1mL10%的三氯乙酸。取2.5mL反应液，加入蒸馏水2.5mL和0.1%氯化铁0.5mL。在700nm处测吸光值，吸光值越高说明样品的还原性越强。以0.5mg/mL的抗坏血酸为参照。

1.2.7.2清除超氧阴离子自由基能力的测定

配制的样品浓度为1mg/mL，试验方法同1.2.3所述。

1.2.7.3热稳定性试验

配制的样品浓度为1mg/mL，将样品溶液分别经过30、50、70、90℃水浴处理30min后，以邻苯三酚自氧化法测抗氧化活性，加入样品1.0mL。

2结果与分析

牡蛎的原血浆、粗蛋白、血浆纯化蛋白均具有不同程度的抗氧化效果，以血浆纯化蛋白的效果最优，而原血浆和粗蛋白次之，纯化血浆蛋白在与原血浆和粗蛋白的蛋白含量之比为1:10时即可表现出与原血浆和粗蛋白相似的抗氧化活性。

2.1原血浆的蛋白含量测定结果

经考马斯亮蓝法测定原血浆后，确定牡蛎原血浆的蛋白含量是11.25mg/mL。

2.2原血浆的蛋白抗氧化结果

按照1.2.3的方法进行清除超氧阴离子自由基能力的测定，以清除率和加入原血浆的量作图。由图1可知，牡蛎原血浆具有清除超氧阴离子自由基的能力，清除率随加入量的增大而增加。总体来说，在低浓度情况下清除能力不是很高，而在比较高的浓度下，清除率非常显著。加入样品体积达到1.0mL时，清除率达到了89.89%。

2.3血浆粗蛋白抗氧化结果

按照1.2.3的方法进行清除超氧阴离子自由基能力的测定，以清除率和加入粗蛋白的量作图。由图2可知，牡蛎血浆粗蛋白同样具有清除超氧阴离子自由基的能力，清除率在开始时随加入量的增大而增加，但当加入量达到0.6mL以后清除率则趋于平缓，达到最大值61.54%。

2.4蛋白质纯度鉴定以及相对分子质量的测定

血浆蛋白的层析图谱如图3，在层析中有2个峰，其中Ⅱ峰的蛋白含量很低且无抗氧化活性，Ⅰ峰蛋白含量高且具有抗氧化活性。纯化后获得的抗氧化蛋白质为单一条带，由标准蛋白可知其相对分子质量约为15ku，结果见图4。

2.5抗氧化活性蛋白的部分性质

2.5.1抗氧化活性的测定

2.5.1.1还原能力的测定

加入不同量的纯化血浆蛋白，按照1.2.7.1的方法进行还原能力的测定，以反应体系的吸光值和加入样品的量作图，同时以抗坏血酸为对照，结果见图5。由图5可知，样品的还原能力较强，还原能力随加入量的增大而增加，但明显低于抗坏血酸。

2.5.1.2清除超氧阴离子自由基的测定

按照1.2.7.2的方法进行清除超氧阴离子自由基能力的测定，以清除率和加入样品的量作图。由图6可知，牡蛎血浆纯化蛋白也具有清除超氧阴离子自由基的能力，清除率随加入量的增大而增加。从总体上看，在低浓度情况下清除能力比较差，而在比较高的浓度下，清除率显著，加入样品体积达到1.0mL时，清除率达到56.18%。

2.5.1.3热稳定性试验

样品溶液分别经过30、50、70、90℃水浴处理30min后，利用邻苯三酚自氧化法测定其抗氧化活性，结果见图7。由图7可知，纯化牡蛎血浆蛋白在30~50℃的温度范围内清除率变化较小，当处理温度升高到50℃以上时，清除率的下降开始加快，有可能是因为较高的温度会使蛋白质的部分结构和性质发生改变，而使其抗氧化活性下降。由图7可知，纯化牡蛎血浆蛋白在30~50℃的温度范围内清除率变化较小，当处理温度升高到50℃以上时，清除率的下降开始加快，有可能是因为较高的温度会使蛋白质的部分结构和性质发生改变，而使其抗氧化活性下降。

3讨论

研究发现，自由基具有很高的化学活性，它一方面是机体有效防御系统的一部分，另一方面也是许多疾病的诱因[7-8]。自然界中的很多动物和植物体内都含有具有良好抗氧化活性的物质，不但有抗氧化、防衰老的作用，还能防病、治病且无毒副作用。因此，目前在全球范围内掀起了一股发掘天然具备抗氧化活性的物质并将其应用于药物和食品工业的潮流[9]。无疑，对天然产物中的抗氧化活性物质的研究，已成为当今最活跃也是最有潜力研究方向之一[10-11]。通过国际上各大科研院所做的大量研究表明，牡蛎提取物具有降血糖、增强免疫力、降血压和抗肿瘤等诸多功效。除了研究较为广泛的多糖、氨基酸等物质外，牡蛎还中含有大量的蛋白质，其在血浆中的含量丰富，浓度达11.25mg/mL。本试验对其血浆成分进行了较为深入的研究，旨在使人们对牡蛎血浆及其所含蛋白的抗氧化作用有更加全面彻底的了解。本文报道了牡蛎血浆及从血浆中分离出的一种蛋白质，结果表明二者均具有良好的抗氧化活性。牡蛎血浆纯化蛋白具备还原能力以及较好的清除羟基自由基的能力，对超氧阴离子也有显著的清除能力，在30~50℃的水浴处理后仍保持稳定。对于该蛋白的抗氧化作用机制、构效关系及牡蛎中其他活性成分的分离纯化与活性测定还有待进一步研究和探讨。