氨基酸菌剂制备与其在卷烟的运用

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本文作者：胡延奇作者单位：山东中烟工业有限责任公司

L-瓜氨酸（L-citrulline）又名氨基甲酰尿氨酸，一种非蛋白氨基酸。1914年右贺太郎从西瓜榨汁中首先分离得到，此后学者发现其为一种氨基酸，故将其命名为瓜氨酸。瓜氨酸以游离态存在于多种生物体内[1]，在动物体内瓜氨酸参与尿素循环（Krebs-Henseleit），起到氨解毒的作用，可用于保护肝脏。研究发现瓜氨酸在人体内还可以起到血管舒张[2]、诊断类风湿关节炎[3]、促进男子性功能等多种生理功能。同时，瓜氨酸具有清除羟基的功能[4]，在分子生物学试验中被用作DNA和酶的保护剂[5]。此外，瓜氨酸作为抗氧化剂还常用于化妆品及食品等领域。瓜氨酸因其多种保健功能成为了近年来国内外学者关注的热点。瓜氨酸的制备方法主要有：化学法、提取法、发酵法[6]、酶法[7-11]等。化学法合成瓜氨酸，产物回收率较低，产品多为DL-型外消旋体，分离困难，并且操作中引入了有机试剂，存在着潜在的健康威胁。提取法主要从生物体内提取瓜氨酸，成本高，工艺繁琐，不利于工业化。发酵法多为从自然界中筛选出可高产瓜氨酸的菌株进行发酵生产。发酵法生产瓜氨酸成本低，产量高，但是微生物代谢中，瓜氨酸作为中间产物存在，发酵液中可能含有精氨酸、鸟氨酸等多种氨基酸以及培养基成份，不利于后期分离纯化。酶法是以精氨酸脱亚氨基酶为催化剂，催化L-精氨酸生产L-瓜氨酸。应用工程菌进行精氨酸脱亚氨基酶的生物合成，生产周期短，积累量大，随后可进行生物转化生产瓜氨酸，体系内杂质种类少、催化效率高、催化专一性强。拟通过对L-瓜氨酸的工程菌（带有精氨酸脱亚氨基酶基因）生产技术及其在卷烟中的应用研究。以期为L-瓜氨酸的制备及其应用提供新思路。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌种

本单位构建的基因工程菌，以带有精氨酸脱亚氨基酶基因的pET-22b(+)为载体，E.coliBL21(DE3)为宿主。1.1.2主要试剂L-瓜氨酸，Sigma公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG，胰蛋白胨、酵母抽提物、氨苄青霉素（Amp），均购自上海生工；其它试剂均为国产分析纯。1.1.3培养基种子培养基LB（g/L）：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g，pH为7.0；发酵培养基：葡萄糖，胰蛋白胨，氯化钠，MgSO4•7H2O，K2HPO4•3H2O，pH7.0。灭完菌后加入50mg/L的氨苄青霉素（Amp）。

1.2试验方法

1.2.1培养及诱导方法

挑取单菌落于3.5mL液体LB培养基（含Amp）中培养过夜。按2%（v/v）的接种量接种于50mL发酵培养基（含Amp），37℃、200r/min培养至OD600约为0.8时加入诱导剂IPTG0.1mM，28℃诱导5h。

1.2.2细胞转化法测定酶活

将培养完后的菌液离心（2000g，10min）收集菌体，用0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）充分洗涤，再离心得到菌体。将菌体加入到pH6.0磷酸盐缓冲液中（将20mL发酵液离心所得菌体加入到20mL细胞转化反应体系中，底物精氨酸浓度为50g/L），40℃、180r/min反应，反应完后离心过滤测定上清中瓜氨酸的含量。

1.2.3细胞转化法制备瓜氨酸的研究

1.2.3.1pH对瓜氨酸合成的影响

分别配置200mmol/L的HAC-NaAC（pH4.0，5.0）、KH2PO4-NaOH（pH=6.0，7.0）、Tris-HCl（pH8.0）缓冲液。采用20mL反应体系，50g/L的底物精氨酸，20g/L菌体，40℃，180r/min水浴振荡反应5h后立即加热煮沸终止反应，测定产物含量。

1.2.3.2温度对瓜氨酸合成的影响

最适温度：采用20mL反应体系，50g/L的底物精氨酸，20g/L菌体，对pH10的缓冲体系，分别在温度为20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃下，180r/min水浴振荡反应5h后立即加热煮沸终止反应，测定产物含量。

1.2.3.3底物浓度对瓜氨酸合成的影响

采用20mL反应体系，10~100g/L不同浓度的底物精氨酸，20g/L菌体，pH6.0，40℃，180r/min水浴振荡反应5h后立即加热煮沸终止反应，测定产物含量。1.2.3.4菌体生产能力指标采用20mL反应体系，50g/L的底物精氨酸，20g/L菌体，pH6.0，40℃，180r/min水浴振荡反应；5h后离心回收菌体，同样的反应体系反应6h；重复4次，每次反应时间相应增加1h。

1.2.4瓜氨酸的检测方法

定性检测：纸层析法，新华一号层析纸（杭州新华纸业，裁成30×20cm），将样品点样2μL，制成圆筒，垂直展开，展开相采用正丁醇:冰醋酸:水（60:15:25），内含0.4%的显色剂茚三酮，展开结束后自然晾干溶剂，85℃显色10min，显色强度与标样比较。定量检测：高效液相测定法，采用分析仪器柱前衍生化定量测定氨基酸，采用ODSC18（Φ4.6×250mm），40℃分析，检测波长338nm，氨基酸定量用外标法定量。

1.2.5卷烟样品制备

按照卷烟国家标准GB506.4-1996，将上述制备的L-瓜氨酸用75%乙醇溶液溶解，以加香方式施加于某牌号卷烟空白叶组烟丝中；在温度(22±1)℃、相对湿度60%±1%条件下平衡24h后，将烟丝卷制成烟支；再次平衡24h后，与空白烟一起进行评价。

2结果及讨论

2.1培养基优化

在单因素基础上进行了正交优化。

2.1.1碳源对瓜氨酸生成量的影响

以葡萄糖作为碳源，其它成分为（g/L）：胰蛋白胨20，MgSO4•7H2O1，K2HPO41，NaCl5，配制不同浓度碳源的培养基。经过培养、诱导、离心收集细胞和细胞转化反应后测定反应液中瓜氨酸的含量，结果如图1。图1表明，起始时随着葡萄糖浓度的增加发酵液的酶活逐渐增加，此时葡萄糖为微生物的生长代谢提供碳源；当葡萄糖浓度到达5g/L时，单位发酵液的酶活最高；此后，随着葡萄糖浓度的增加单位发酵液的酶活开始降低，原因可能是葡萄糖效应影响了微生物的生长代谢。

2.1.2氮源对瓜氨酸生成量的影响

以胰蛋白胨作为氮源，其它成分为（g/L）：葡萄糖5，MgSO4•7H2O1，K2HPO41，NaCl5，配制不同浓度氮源的培养基。经过培养、诱导、离心收集细胞和细胞转化反应后测定反应液中瓜氨酸的含量，结果如图2。胰蛋白胨可为微生物生长代谢提供丰富的营养，尤其是为蛋白质合成提供材料。由图2看出，随着胰蛋白胨浓度的增加，瓜氨酸生成量逐渐增加，当超过20g/L后瓜氨酸生成量的增加趋于平缓。

2.1.3发酵培养基的正交优化

基于对碳源和氮源单因素研究的结果，选取葡萄糖，胰蛋白胨，MgSO4•7H2O，K2HPO4•3H2O作为研究因素，进行正交试验设计。经过培养、诱导、离心收集细胞和细胞转化反应后测定反应液中瓜氨酸的含量，结果如表1所示。由正交试验结果可以得到最佳的培养基为（g/L）：葡萄糖5，胰蛋白胨20，K2HPO4•3H2O1，MgSO4•7H2O1，其中胰蛋白胨的影响最大，K2HPO4•3H2O次之。

2.2诱导条件优化

pET质粒表达系统含有乳糖操纵子，进行目的基因表达需要乳糖或其结构类似物的诱导，IPTG作为乳糖的结构类似物在微生物代谢中不被利用，常被用作诱导剂。考虑到IPTG的毒性，研究了乳糖对工程菌诱导表达的影响。经过培养、诱导、离心收集细胞和细胞转化反应后测定反应液中瓜氨酸的质量浓度，结果如图3。由图3可知选取乳糖作为诱导剂对瓜氨酸的合成影响不大，完全可以替代IPTG。随后选取加诱导剂时细胞OD值，诱导温度，诱导时间，诱导剂量等作为研究因素，进行正交试验设计。经过培养、诱导、离心收集细胞和细胞转化反应后测定反应液中瓜氨酸的含量，结果如表2所示。由结果可知最佳诱导条件为：OD值1.0，诱导温度25℃，诱导时间7h，乳糖量5g/L，其中诱导时间影响最大，诱导温度次之。

2.3细胞转化体系研究

2.3.1pH对瓜氨酸产量的影响

考察了pH对瓜氨酸合成的影响，环境pH值会影响与酶的催化有关的氨基酸残基的离子化状态，影响影响酶的构象，影响底物与酶活性中心的结合。以底物转化率最高的为100%相对转化率作图，结果如图4所示，瓜氨酸合成的最佳pH为6.0。

2.3.2温度对瓜氨酸合成的影响

考察了温度对瓜氨酸合成的影响，如图5所示，细胞转化反应合成瓜氨酸的最适反应温度是40℃。随着温度的升高，酶活性不断增强，当温度达到一定值后，酶活性开始下降，这是由于温度升高到一定值后，酶开始变性，构象发生变化，影响了酶的活性。

2.3.3底物浓度对瓜氨酸合成的影响

对于菌体添加量为20g/L的体系，考察了底物浓度对细胞转化反应的影响，如图6所示，精氨酸质量浓度在60g/L以下时，底物转化率均在90%以上；精氨酸浓度高于60g/L后，瓜氨酸的生成量的增加趋缓，分析原因可能是瓜氨酸作为精氨酸的结构类似物，会与精氨酸竞争结合精氨酸托亚氨基酶的活性中心，影响酶的催化效率，因此对于菌体添加量为20g/L的细胞反应体系，底物浓度应为60g/L。

2.3.4菌体生产能力指标

稳定性和可重复性是酶重要指标，可为工业化应用提供依据。考察了工程菌的重复利用情况，对于菌体添加量为20g/L，精氨酸浓度为60g/L的体系，比较了不同批次细胞转化反应的产物生成量。从图7中可以看出工程菌重复使用3次，产物产量稳定，第4次产量较降幅度较大，不再适合工业化生产。

2.4L-瓜氨酸在卷烟中的应用结果

将前述制备所得的L-瓜氨酸分别按0.01%，0.02%，0.04%，0.06%的用量按加香方式施加于某品牌卷烟混合丝；其结果分别如下表3所示。由表3可知，随着L-瓜氨酸用量的增加，卷烟香气量呈增加趋势；但各香韵间的协调性略有降低，且不舒适的杂气较重。对比评吸结果表明当其用量为0.02%时，综合效果相对较好。

3结论

综上所述，工程菌的最佳培养基为（g/L）：葡萄糖5，胰蛋白胨20，K2HPO4•3H2O1，MgSO4•7H2O1；最佳诱导条件为：OD值1.0，诱导温度25℃，诱导时间7h，乳糖量5g/L；对于菌体浓度为20g/L的20mL细胞转化反应体系，工程菌细胞生产瓜氨酸的最佳条件为：pH6.0，温度40℃，精氨酸浓度为60g/L，产量达55.1g/L，细胞可连续使用三次，且产量稳定，具有一定的工业应用价值。在卷烟中的应用初步研究结果表明：在卷烟生中，加入一定量的L-瓜氨酸可提升卷烟的香气量、香气质和改善余味等感官质量指标。