多环麝香污染对蚯蚓的影响探析

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HSP70是HSP家族中最保守和最重要的一类应激蛋白，其自身表达水平与生物体受环境胁迫时细胞组织损伤及自身防御能力关系密切［9］．钙网蛋白(calretuculin，CRT)是动物和高等植物体内普遍存在且高度保守的一种内质网钙结合蛋白，具有维系细胞Ca2+稳态、调节蛋白质折叠和细胞凋亡等多种生物学功能［10］．ilerová等［11］首次克隆蚯蚓Eiseniafetida的CRT基因并鉴定其生物功能．亲环素A(cyclophilinA，cyPA)作为一类具有肽基脯氨酸顺反异构酶活性的免疫亲和素，主要参与免疫调节和信号转导，并发挥细胞因子的功能，在细胞生命活动中发挥重要作用，且对生物体炎症的发生、细胞凋亡等具有调控作用．翻译控制肿瘤蛋白(translationallycontrolledtumorprotein，TCTP)最初发现于肿瘤组织，被认为是一个在翻译水平受到抑制的肿瘤相关蛋白，而后被发现是一种普遍存在并且大量表达的蛋白，在进化上高度保守，主要参与细胞周期的调控，对肿瘤细胞增殖和凋亡具有双重作用．目前，关于外源污染物暴露胁迫下蚯蚓特异性蛋白基因表达的研究还较为缺乏．鉴于污染物与生物体之间的相互作用始于分子水平［12，13］，因此，有必要开展分子水平上多环麝香土壤污染胁迫蚯蚓特异性蛋白基因响应表达的研究．本研究以蚯蚓HSP70、CRT、cyPA、TCTP等胁迫蛋白类基因为主要对象，通过检测分析低剂量AHTN或HHCB长期暴露胁迫下各特异性蛋白基因在转录水平上的表达量，以期筛选出敏感的分子生物标志物，应用于多环麝香污染土壤中亚急性毒性效应的早期分子诊断和生态风险评价中．

1材料与方法

1.1供试污染物和供试动物吐纳麝香(7-乙酰基-1，1，3，4，4，6-六甲基-1，2，3，4-四氢萘，AHTN)购自上海力智生化科技有限公司，纯度99%;佳乐麝香(1，3，4，6，7，8-六氢-4，6，6，7，8，8-六甲基环五-γ-2-苯并吡喃，HHCB)购自天津中科健化工有限公司，纯度99%．毒理实验中采用的蚯蚓为赤子爱胜蚓(Eiseniafetida)，是国际标准毒理试验模式生物之一，购自南开大学教研基地天津芦台贾立明蚯蚓养殖场．选择2～3个月龄、有明显生殖环带、体重为400～450mg的已筛选驯化后的成年蚯蚓作为供试受体生物．

1.2实验方法

1.2.1蚯蚓特异性蛋白基因mRNA表达的RT-qPCR检测按照试剂盒说明书Trizol法提取蚯蚓总RNA［14］．取1μg总RNA，采用逆转录酶ReverTraAce-a-(Toyobo，日本)合成cDNA．根据GenBank已发表的蚯蚓HSP70、CRT、TCTP、cyPA等基因cDNA序列信息，采用PrimerExpress3.0设计RT-qPCR扩增引物(表1)．RT-qPCR扩增反应体系为20μL，其中SYBRGreenⅠMix(Bio-rad，美国)10μL，ddH2O6.4μL，上下游引物(10μmmol•L－1)各0.8μL，cDNA2.0μL．反应条件为95℃预变性2min，45个循环(95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸采集荧光信号30s)．PCR反应结束后熔解曲线分析:95℃1min;60℃1min，60℃30s后，温度0.5℃•s－1递升至95℃结束．PCR产物经纯化、连接转化、克隆筛选等操作步骤，任选3个重组质粒由北京华大基因公司测序．采用NCBI数据库中BlastX程序将供试基因与已发表基因间序列进行同源性比较．

1.2.2AHTN或HHCB28d暴露胁迫下蚯蚓特异性蛋白基因表达供试自然土壤取自天津塘沽森林公园，为未受工农业污染的洁净表层土壤(0～20cm)，风干后过2mm筛待用，土壤理化性状、污染物土壤背景值以及土壤染毒与配制具体方法见笔者前期研究［7］．根据AHTN与HHCB土壤亚急性毒性的效应浓度［7］，土壤长期暴露实验染毒浓度设置5个梯度水平，分别为3、10、30、50和100μg•g－1．早期研究表明［17］，丙酮经过充分挥发后对蚯蚓几乎无毒性影响，而且去离子水与丙酮对照组中基因表达水平无差异变化，因此，本研究仅设置丙酮试剂空白作为对照组．每个浓度处理组与对照组均设置4个平行．暴露28d结束后，分别于各处理组中任意挑选4条蚯蚓，即每条蚯蚓作为一个待测样品，重复4次，进行基因表达水平的定量分析．1.2.3数据处理与分析以β-actin作为持家基因，对各供试目的基因mRNA表达水平进行定量分析。基因表达数据以平均值±标准偏差(mean±SD)的方式表示．数理统计均采用SPSS13.0软件包分析．不同处理组间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)，多重比较采用Duncan法，显著性差异水平为P＜0.05。

2结果与分析

2.1蚯蚓总RNA的纯度与完整度由图1可见，蚯蚓总RNA完整性较好，其28S与18S条带清晰;并且RNA的A260/A280比值均在1.8～2.0之间，表明抽提的总RNA纯度较高．因此，Trizol法提取RNA可满足cDNA合成和RT-qPCR反应需求．

2.2RT-qPCR引物设计合理性的验证通过测序比对结果可知(表2)，供试基因分别与已收录的HSP70、CRT、cyPA和TCTP基因序列信息高度相似，表明RT-qPCR引物的设计可满足目的供试基因片段扩增检测要求．各供试基因的熔解曲线皆为特异的单个峰(图2)，没有出现引物二聚体与非特异性扩增，更加说明本研究引物设计以及RT-qPCR反应体系条件的建立适用于供试基因的特异性检测．

2.3AHTN、HHCB28d暴露胁迫下蚯蚓特异性蛋白基因mRNA的响应表达暴露于AHTN或HHCB污染土壤28d后，蚯蚓各目的基因HSP70、CRT、cyPA和TCTPmRNA表达变化趋势如图3所示．当蚯蚓暴露于较低染毒剂量的AHTN(3μg•g－1和10μg•g－1)或HHCB(3、10和30μg•g－1)处理组时，其HSP70基因表达水平无明显变化;而暴露于较高浓度AHTN(30、50和100μg•g－1)或HHCB(50μg•g－1和100μg•g－1)处理组时，HSP70基因表达水平分别较对照组水平显著下调(P＜0.05)．总体而言，AHTN或HHCB长期污染对HSP70基因表达水平均有显著下调抑制作用(P＜0.01)．且HSP70基因表达水平与AHTN或HHCB暴露浓度呈负相关关系(AHTN:r=－0.829;HHCB:r=－0.717，P＜0.01)．当蚯蚓暴露于3、10、50和100μg•g－1的AHTN污染土壤28d后，CRT基因表达量较对照组均显著性上调(P＜0.05)，分别为对照组水平的2.2、1.8、5.0和2.0倍．10、30、50和100μg•g－1HHCB暴露处理组中的CRT基因表达水平也均显著性上调(P＜0.05)，分别为对照组的2.9、3.2、1.8和2.3倍．与对照组相比较，蚯蚓暴露于AHTN或HHCB污染土壤28d后，各浓度处理组的cyPA和TCTP基因表达水平均无显著性差异(P＞0.05)．

3讨论

目前，由于暂时无法完全获知污染物胁迫毒性作用的早期反应及真正靶位，于是难以对污染物的环境暴露水平与生态毒性效应给予准确、及时的预测评估，而以特定污染物所致生物体表达谱(基因或蛋白质水平表达)的改变作为污染物专一暴露的分子生物标记物，可以更加灵敏准确地对环境中一些持久性有机污染物的生态安全性做出早期预警和监测评价［19］．本研究发现暴露于高浓度AHTN或HHCB污染土壤28d后，蚯蚓HSP70基因表达水平受到显著抑制;与之前滤纸急性毒性试验结果相一致，高浓度AHTN或HHCB滤纸接触染毒48h后，蚯蚓HSP70基因下调表达，主要是由活性氧自由基引起的氧化应激水平所诱导［17］．此外，在某些水生毒理学研究中也发现HSP70下调表达的现象．Lee等［20］研究发现四氯化碳、杀螟硫磷、壬基苯酚等污染物可抑制水生生物摇蚊幼虫Chironomustentans的HSP70基因表达．Rhee等发现壬基酚、辛基酚等胁迫下HSP70基因表达表现为下调抑制，而双酚A暴露则会诱导HSP70基因上调表达，认为其原因是不同种类分泌干扰物暴露胁迫对HSP70基因表达方式可能存在差异［21］．蚯蚓CRT基因表达水平在AHTN或HHCB土壤污染胁迫下表现为显著诱导上调，其原因可能是CRT为了行使“分子伴侣”的生理功能或维系机体内Ca2+动态平衡而激发诱导CRT基因表达［22］．CRT基因的上调表达也是生物体应对氧化应激压力的响应方式，是为了防御或降低细胞氧化应激损伤效应．多环麝香污染胁迫引起的蚯蚓体内活性氧自由基累积，可以起脂质过氧化并导致内质网的损伤，从而诱导蚯蚓机体内Ca2+水平的迅速提升，而CRT作为Ca2+的调控基因则表现位持续的上调表达［23］．不同种类外源污染物暴露胁迫对cyPA基因表达方式并没有表现出一定的规律．Stürzenbaum等［24］研究发现暴露于Cd、Pb、Zn、Cu等混合重金属污染土壤6周后，蚯蚓L．rubellus的cyPA基因表达水平显著增加;而Brulle等［16］研究认为Cd土壤暴露6d后，蚯蚓E．fetida的cyPA基因表达却被抑制显著下调．本研究结果显示AHTN和HHCB长期(28d)污染暴露对蚯蚓cyPA基因表达无显著性影响．因此，cyPA基因尚且不具备作为分子生物标志物的特征，不适合用于多环麝香生态毒理效应的分子诊断．Api等［25］早期研究认为，多环麝香AHTN或HHCB不具备遗传毒性致癌物的一些基本特性．本研究也发现，在AHTN或HHCB污染土壤长期暴露下，蚯蚓翻译控制肿瘤蛋白基因(TCTP)的表达水平无显著性变化差异，从侧面说明了AHTN或HHCB没有显现可能致癌的特性．

综上分析，HSP70mRNA水平下调与CRTmRNA水平上调的响应表达是为了保护蚯蚓抵御自由基氧化应激损伤，两基因有望成为表征多环麝香土壤污染暴露水平及生态毒理效应的潜在生物标志物．考虑到分子毒理学研究中蚯蚓基因数据库信息相对较少，对于具备潜在分子生物标志物特征的特异性基因，还需要开展cDNA全序列克隆及其编码蛋白质的结构分析，为丰富蚯蚓基因序列数据库和构建蚯蚓基因芯片检测平台奠定基础，进而更有利于拓展多环麝香污染胁迫下高通量基因表达谱的研究．今后，还必须从生态毒理基因组学和蛋白质组学角度，综合分析多环麝香污染物胁迫下蚯蚓特异性基因表达与调控的变化，揭示多环麝香的毒理机制与毒性作用靶位，从而构建多环麝香土壤污染早期预警的蚯蚓分子诊断技术体系．

4结论

(1)RT-qPCR引物的设计以及PCR反应体系条件的建立适用于各供试基因转录水平表达的特异性检测．(2)AHTN或HHCB土壤污染暴露胁迫下，蚯蚓HSP70基因表达水平受到显著抑制，而CRT基因表达水平显著诱导上调;cyPA和TCTP基因表达水平均无显著性变化．(3)HSP70与CRT两基因将有可能作为潜在生物标志物，可应用于预测和评估土壤多环麝香污染水平及生态毒性效应．

作者：陈春刘潇威郑顺安周启星李松单位：农业部环境保护科研监测所农业部产地环境与农产品安全重点开放实验室南开大学环境科学与工程学院环境污染过程与基准教育部重点实验室中国石油冀东油田公司油气集输公司