肠道环境论文:果胶对肠道环境的影响

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作者：吕娇苏昕峰方国珊刘雄单位：西南大学食品科学学院

大量的研究表明，果胶作为肠道益生因子，有利于肠道中乳酸菌、双歧杆菌的生长，产生丰富的SCFAs（short-chainfattyacids）改善肠道pH，促进肠细胞生长，抑制结肠癌等[5-8]。前人研究结果暗示果胶可能具有改善辣椒素引起的肠道环境的不适症状。薛荔做为一种野生常绿攀援植物常见于我国各省，适应力强，易于种植。并且瘦果籽中含有丰富的果胶，研究表明薛荔籽果胶酯化度为38.57%，属于酸性低酯果胶[9]。因此，本实验选择薛荔籽果胶作为添加物，考察果胶添加是否会改善辣椒素引起的肠道不适。由于体外发酵作为动物实验的补充有很多优点：它可以跟踪发酵过程中物质的变化及研究发酵产物的形成过程，弥补了体内发酵不能实现动力学检测的缺点；它还可以实现标准化操作，实验的重复性强。因此，本文拟采用体外发酵试验观察果胶与辣椒素对肠道发酵环境的影响，以期为辣椒的科学消费提供理论指导。

1材料与方法

1.1材料与试剂薛荔果胶由实验室研究自制。天然辣椒素(辣椒碱含量为95.7%)由河南倍特生物科技有限公司提供。氯化钠（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、硫酸（优级纯）、亚硝基铁氰化钠（分析纯）、苯酚（分析纯）、次氯酸钠（分析纯）、冰乙酸（分析纯）、吐温80（分析纯）、氯化铵（分析纯）、咔唑（分析纯）成都市科龙化工试剂厂；乙酸(色谱级)AJohnsonMattheyCompany；巴豆酸（色谱级）、丙酸(色谱级)、丁酸(色谱级)、异丁酸(色谱级)梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；EMB培养基（生化试剂）北京奥博星生物技术有限公司；BS培养基（生化试剂）、LBS培养基（生化试剂）青岛海博生物技术有限公司；D-半乳糖醛酸（分析纯）北京索莱宝科技有限公司；高纯二氧化碳气体（99.999%）重庆朝阳气体有限公司。

1.2仪器与设备Sepctrumlab22可见分光光度计上海棱光技术有限公司；WH-1微型旋涡混合仪上海沪西分析仪器厂；JA2003A电子天平上海精天电子仪器有限公司；DHG-9070电热恒温鼓风干燥箱上海齐欣科学仪器有限公司；PHS-3C精密酸度计上海大普仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅金坛市富华仪器有限公司；5810型台式离心机德国Eppendorf公司；SIGMA低温离心机德国SIGMA公司；ARI14紫外分光光度计上海爱朗仪器有限公司；GC-2010气相色谱日本岛津公司；KQ-100超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；SW-CJ-1FD洁净工作台苏州安泰空气技术有限公司；HH-B11电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂；BC-J160S二氧化碳细胞培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ES-315高压蒸汽灭菌锅KAGOSHIMASEISAKUSYOINC；ZHWY-100C恒温培养振荡器上海智诚分析仪器制造有限公司；Stabilwax-DA毛细色谱柱美国RESTEK公司。1.3试验方法

1.3.1果胶提取与测定

1.3.1.1果胶提取[10]称量薛荔籽，在水浴锅中提取（料液比：1:10（m:V）、60℃搅拌2h）。方法一：真空浓缩滤液——真空冷冻干燥——粉碎——成品薛荔籽胶。方法二：AB-8型大孔树脂脱色过滤——真空旋转浓缩至1/3——用95%乙醇沉析，静置一夜——用65%乙醇洗涤两次——真空冷冻干燥——粉碎——成品薛荔籽果胶。

1.3.1.2果胶纯度测定[11]标准曲线绘制：精确称取D-半乳糖醛酸标准品10mg，用蒸馏水定容于100mL容量瓶中，制成100μg/mL的标准溶液。移取上述标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于25mL具塞刻度试管中，再加入蒸馏水稀释至1mL，即得一组浓度为0、20、40、60、80、100μg/mL的半乳糖醛酸标准液。然后小心沿管壁分别加入6.0mL浓硫酸，在沸水浴中加热20min，取出冷却至室温，再分别加入0.2mL，1.5g/L咔唑-乙醇溶液，摇均。在暗处放置30min，取出测定反应液在波长526nm处的吸光度，用蒸馏水做空白实验，制作标准曲线：y=0.0116x–0.002，R2=0.9981。称取10mg实验室自制薛荔籽果胶，溶解后定容至100mL容量瓶中，吸取1mL果胶溶液至25mL比色管做上述处理，根据标准曲线计算D-半乳糖含量。

1.3.2发酵液制备

1.3.2.1发酵液配比通过查阅大量相关文献及本研究室前期的实验表明，对采用不同剂量灌喂一月后的大鼠进行详细的检测后，发现添加5%果胶就能明显增加大鼠盲肠内容物中SCFA总量，而添加0.1%辣椒素组的大鼠其血脂变化及对肠道的伤害作用最为明显。发酵液各物质添加量见表1。其中果胶根据接种盲肠内容物重量的5%添加，辣椒素根据发酵液总体积添加（m:V），添加量为0.1%。

1.3.2.2体外发酵步骤1)无菌条件下取出6只雄性大鼠的盲肠内容物，装入预先灭菌的50mL带盖离心管中，称重，鼓入高纯CO2气体5min，盖上盖子待用。2)用9倍(V:m)无菌生理盐水稀释盲肠内容物，涡旋震荡5min混匀，4层纱布过滤。3)取12支100mL高温灭菌后的高温瓶，每支高温瓶中加入5mL盲肠内容物滤液和45mL灭菌基础培养液（牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g，pH7.0~7.2，定容至1000mL），将高温瓶分为4组（每组3支），按实验要求分别加入果胶或辣椒素（见表1），鼓入高纯CO2气体20min，盖好橡胶塞后蜡封。在60~80r/min转速的恒温培养振荡器上37℃摇床培养10h，终止发酵，检测发酵液中pH、游离氨、SCFA及微生物。

1.3.3生化指标检测

1.3.3.1pH测定发酵液样品5mL于4000r/min下离心5min，吸取上清液2mL，用精密酸度计测上清液pH。

1.3.3.2发酵液游离氨测定无氨水制备[12]：在1000mL蒸馏水中，加入0.10mL硫酸（ρ=1.84g/mL）。并在全玻璃蒸馏器中重蒸馏，弃去前50mL馏出液，然后将馏出液收集在带有玻璃塞的玻璃瓶中。发酵液样品于4000r/min下离心5min，吸取上清液1mL，依次加入1mL含有0.001mol/L亚硝基铁氰化钠的0.5mol/L苯酚溶液和1mL含有0.03mol/L次氯酸钠的0.625mol/L氢氧化钠溶液，60℃保温5min，625nm波长下测吸光度[13]。配制5mmol/L氯化铵溶液，分别移取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mL溶液于4mL比色皿中，无氨水稀释至1.0mL，按上述步骤测吸光值，绘制标准曲线：y=0.108x+0.008，R2=0.9991。

1.3.3.3发酵液SCFA测定盲肠内容物发酵液样品在4000r/min转速下离心15min，吸取上清液转移至超纯水预处理过的10mL离心管中，10000r/min转速下继续离心15min，1mL一次性注射器吸取上清液1mL，0.22μm滤膜过滤至2mL进样小瓶中待测[14]。气相色谱条件：进样量1μL；进样口温度220℃；柱流量0.95mL/min，柱温90℃、平衡时间0.5min，5℃/min升温至150℃，保留时间7min；检测器温度230℃；氢气流量40mL/min，空气流量400mL/min，尾吹流量40mL/min[15]。

1.3.3.4发酵液微生物测定取发酵液1mL，加入9mL无菌生理盐水，依次10倍稀释至10-7。选择10-5、10-6、10-7三个稀释度，用于大肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌的培养计数，接种量为100μL。大肠杆菌培养选用EMB培养基，37℃下恒温培养箱中培养48小时计数。双歧杆菌和乳酸杆菌分别选用BS培养基和LBS培养基，将培养皿蜡封后，在37℃下二氧化碳细胞培养箱中厌氧培养72小时计数。结果以logcfu/mL表示。

1.4统计分析实验结果以mean±SD表示，各组间显著性差异采用SPSS分析，P<0.05被认为有显著差异。

2结果与分析

2.1薛荔籽果胶纯度称取10mg薛荔籽果胶溶于100mL蒸馏水中，取1mL果胶溶液，按照3.2.1.2方法测得吸光度为0.11，对应D-半乳糖醛酸含量为9.655μg/mL。果胶纯度为96.55%。

2.2发酵液pH变化趋势pH以盲肠内容物量计算，各发酵液pH变化见图1。从图1可以看出：在各发酵液的初始pH值为5.9的条件下，实验结果显示，相比空白组而言，添加5%果胶的发酵液（P组）pH显著降低，而添加0.1%辣椒素的发酵液（C组）pH则显著升高（P<0.05）。添加5%果胶+0.1%辣椒素的发酵液（P+C组）pH相比0.1%辣椒素组（P组）显著降低。发酵液中pH值的变化主要是由发酵产生的有机酸和游离氨所影响，pH的降低或升高表明有机酸含量或游离氨浓度可能发生了显著的变化。

2.3发酵液游离氨变化趋势果胶和辣椒素对盲肠内容物发酵液中游离氨浓度的影响结果见图2。从图2可以看出：相对于空白组，添加5%果胶（P组）能显著降低的发酵液中游离氨浓度，而添加0.1%辣椒素（C组）则明显增加了的发酵液游离氨浓度（P<0.05）。相对于辣椒素组（P组），添加5%果胶+0.1%辣椒素（P+C组）则明显降低了辣椒素引起的游离氨浓度的升高（P<0.05）。这与发酵液中pH值的升高和降低相对应。

2.4发酵液短链脂肪酸变化趋势果胶对辣椒素引起的盲肠有机酸发酵产物减少的改善效果见图3、图4、图5及图6。从图中可以看出：与对照组相比，添加5%果胶（P组）的盲肠内容物发酵液中乙酸、丁酸、丙酸和总短链脂肪酸浓度均显著升高（P<0.05），而添加0.1%辣椒素组（P组）则显著降低了盲肠内容物发酵液中乙酸、丁酸、丙酸和总短链脂肪酸浓度（P<0.05）。添加5%果胶+0.1%辣椒素的发酵液（P+C组）的短链脂肪酸含量相比0.1%辣椒素组（P组）显著升高（P<0.05）。此结果表明，辣椒素抑制了肠道益生菌对碳水化合物的发酵，减少有机酸的产生，而添加果胶能够有效改善辣椒素对肠道益生菌发酵所产生的不利影响。2.5发酵液微生物数量变化趋势果胶和辣椒素对盲肠内容物发酵液中微生物组成的影响见图7、图8及图9。从图中可以看出：相对于对照组，添加5%果胶组（C组）能显著增加发酵液中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量，减少大肠杆菌的数量，而辣椒素组(P组)则减少了发酵液中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量，增加大肠杆菌的数量（P<0.05）。添加5%果胶+0.1%辣椒素发酵液（P+C组）的乳酸杆菌和双歧杆菌的数量相比0.1%辣椒素组（P组）显著升高，而大肠杆菌数量则显著降低（P<0.05）。此结果表明，辣椒素抑制了肠道益生菌的生长，同时使得有害菌的数量增加，而添加果胶能够有效改善辣椒素对肠道微生物菌群所产生的有害作用。

3结论与讨论

随着人们健康意识的增强，以及营养科学和医药科学的发展，有关食用辣椒对人体健康的利与弊的话题，成为人们关注的一个焦点。国内外研究表明：辣椒素药理作用广泛，在镇痛方面有重要作用，同时具有防治心血管疾病、呼吸道疾病的作用，还能用于减肥[16]、治疗风湿性关节炎、银屑病等[17]。然而，许多食用辣椒的消费者会出现肠道不适，尤其是初次食用或过量食用的消费者，会出现腹痛、拉肚、肛部灼烧感等症状。多数研究表明灌喂辣椒素对人体肠道有不良影响，且与食用剂量有正相关关系，辣椒素主要通过对肠道的化学刺激起作用[18-19]。也有研究发现辣椒素可以刺激肠绒毛增生，促进小肠对营养物质的吸收，从而对肠道健康也起到积极的改善作用[20-21]。然而，肠道菌群对肠道健康至关重要。本研究结果表明，辣椒素可以使盲肠内容物发酵液中有益菌（乳酸杆菌、双歧杆菌）数量减少，有害菌（大肠杆菌）数量增加，导致肠道短链脂肪酸浓度降低，游离氨浓度升高，pH值升高。这可能是辣椒素会引起消费者出现肠道不适症状的原因。而相同剂量辣椒素的盲肠内容物发酵液中，添加果胶可以使发酵液pH值和游离氨浓度降低、短链脂肪酸浓度升高，说明果胶体外发酵对辣椒素引起的盲肠内容物发酵环境恶化有一定的改善作用。其原因可能是果胶体外发酵产生大量短链脂肪酸，使发酵液中pH值降低，有益菌（乳酸杆菌、双歧杆菌）数量增加、有害菌（大肠杆菌）数量减少，游离氨浓度升高。因此，添加果胶可以缓解由辣椒素引起的肠道环境恶化。