环境影响论文:米诺环素微环境对人体的影响

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作者：张达屠冠军韩亚新丛琳梁德勇单位：中国医科大学附属第一医院

动物模型制作与分组：以腹腔内注射10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉，将大鼠俯卧位固定于实验台上。选定T10、T11为正中切口，常规消毒、铺巾，沿皮肤、皮下逐层暴露，显露出T10~T11棘突及椎板并咬除之，暴露硬脊膜。根据Nystrom法用10g力量动脉夹从两边夹住暴露脊髓，造成重复性好的固定压迫，压迫时间为5min，用4鄄0号丝线缝合伤口。损伤后每天人工排尿（便）2次，每2d局部消毒1次。模型动物随机分成4组，每组12只。损伤组：运用Nystrom法造成T10~T11节段脊髓损伤；米诺环素组：同法造T10~T11节段脊髓损伤，受伤1h后用50mg/kg的米诺环素经口灌胃，24h后再次给50mg/kg的米诺环素经口灌胃，然后再予5d的25mg/kg的米诺环素经口灌胃；干细胞移植组：同法造T10~T11节段脊髓损伤，伤后第3天重新打开切口，用10滋L微量注射器在脊髓损伤区远端1.5mm处注射10滋L细胞悬液（细胞密度1伊106/mL），避开脊髓中央血管，注射过程不少于2min，留置针头3min以免细胞外泄；联合治疗组：同法造T10~T11节段脊髓损伤，受伤1h后用50mg/kg的米诺环素经口灌胃，24h后再次给50mg/kg的米诺环素经口灌胃，然后再予5d的25mg/kg的米诺环素经口灌胃；同时在伤后第3天重新打开切口，用10滋L微量注射器在脊髓损伤区远端1.5mm处注射10滋L细胞悬液（细胞密度1伊106/mL），避开脊髓中央血管，注射过程不少于2min，留置针头3min以免细胞外泄。

动物标本取材及处理：术后2周，以致死剂量水合氯醛处死大鼠，分别以无菌生理盐水和4%多聚甲醛行左心室灌注。按原手术入路取出已损伤部位为中心远近端各1.5cm长度脊髓。标本在4%多聚甲醛中固定3h，再于新配20%蔗糖溶液浸泡过夜。次日标本沉入蔗糖溶液底部取出，将表面蔗糖溶液吸干。用OCT胶包埋速冻，以损伤中心为目标于冰冻切片机切片，厚度为8滋m，铺于经防脱片处理的载玻片上。进行荧光显微镜细胞计数。

MTT法描绘细胞生长曲线：取4个96孔板，每板分成6组，分别加入准备好的细胞（1伊105/孔），在5%CO2和37益的培养箱中孵育24h后吸出培养液，按照纵行分组在各孔中注入浓度为1、3、6、10、20滋g/mL的米诺环素培养基溶液及空白对照的全培养基各100滋L。在5%CO2和37益的培养箱中孵育24h后，避光条件下各孔中加入10滋LMTT，继续孵育4h后吸出孔内混合液体，加入DMSO溶解，震荡10min。选择570nm波长，自动酶标光度计测定各孔光吸收值，记录结果。以药物浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

统计学分析数据以依表示，采用SPSS16.0统计软件进行分析，2组间均数比较采用检验，多组间比较采用单因素方差分析。<0.05为差异有统计学意义。

荧光显微镜观察脊髓内移植的骨髓间充质干细胞的情况，结果显示米诺环素前期治疗可有效促进细胞的存活和迁移，干细胞移植组和联合治疗组骨髓间充质干细胞数量分别为7.08依2.71和11.9依2.15，与干细胞移植组相比，联合治疗组损伤中心可发现数量更多的骨髓间充质干细胞（<0.05）。损伤组与米诺环素组由于未进行细胞移植，故未发现骨髓间充质干细胞。通过MTT法描绘细胞的生长曲线（图2），反映细胞的生长情况。空白对照组和1、3、6、10、20滋g/mL米诺环素组骨髓间充质干细胞吸光度分别为0.245依0.054、0.263依0.045、0.458依0.085、0.651依0.102、0.619依0.078和0.239依0.051，各组吸光度平均值不全相等（<0.05）。合适浓度的米诺环素能促进细胞增殖，而随着米诺环素浓度的提高细胞增殖能力受到抑制。3、6、10滋g/mL米诺环素组骨髓间充质干细胞吸光度明显高于空白对照组（<0.001），10滋g/mL米诺环素组明显高于20滋g/mL米诺环素组（<0.001），而空白对照组与1滋g/mL和20滋g/mL米诺环素组比较，6滋g/mL米诺环素组与10滋g/mL米诺环素组比较，差异均无统计学意义（>0.05）。

米诺环素是一种半合成的四环素类广谱抗生素。研究发现，米诺环素具有良好的抑制炎性反应作用［4］，完全不同于其抗感染的作用机制，临床上用于类风湿性关节炎等严重的人类炎性疾病的治疗。此外，米诺环素还发挥神经保护的作用，其可以稳定线粒体膜，降低其通透性，减少细胞色素C释放，抑制小胶质细胞激活，减少神经元和少突胶质细胞的凋亡［5］。相关研究还显示［6］，小脑颗粒细胞使用米诺环素处理后再给予N鄄甲基鄄天冬氨酸处理，检测神经元活力，结果显示N鄄甲基鄄天冬氨酸处理细胞活力减少35%，米诺环素预处理的细胞未出现细胞活力下降，提示米诺环素对N鄄甲基鄄天冬氨酸诱导的兴奋毒性有保护作用。Kumer等［7］在糖尿病大鼠成模4周后给予米诺环素（50mg/kg）和阿司匹林（50mg/kg）口服，连续给药4周，结果发现，8周病程的干预组糖尿病大鼠肾功能明显改善。通过以上实验可以得出米诺环素作用广泛，作为一种抗生素，它不仅可以很好地抑制炎性反应，还可以保护神经系统、抑制细胞凋亡、保护肾脏功能。

目前骨髓间充质干细胞以其诸多优点已经成为细胞移植理想的种子细胞［8］。但是从严格意义上来讲，间充质干细胞不具有无限增生的能力，无论在体或者体外，间充质干细胞的增生能力是有限的，而且其增生和进入衰老凋亡的过程受到严格的分子机制调控［9］。所以能否找到一种更合适它生长的微环境便显得尤为重要。本实验分别在大鼠体内和体外制造米诺环素微环境，来观察其对骨髓间充质干细胞生长的影响。在48只脊髓损伤的动物模型中，12只联合治疗组大鼠的脊髓损伤中心可以观察到更多骨髓间充质干细胞，而在体外合适剂量的米诺环素对骨髓间充质干细胞的增殖有一定的促进作用。通过以上的结果，我们可以推测米诺环素对骨髓间充质干细胞的生长起到积极的作用。其可以作为神经系统损伤后骨髓间充质干细胞移植治疗的铺垫和辅助。