真菌复原污染土壤探究

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本文作者：付辉1孟瑶1梁红1董义兴1程方志1郝伟1朱逸格1高大文1,2作者单位：1.东北林业大学2.哈尔滨工业大学

原油是一种比较复杂的混合物，不同地域的原油其成分也有较大的差异，不同环境自然净化过程也有所不同，一般都比较缓慢［1］。在土壤修复过程中，生物修复操作简便、费用低、无二次污染等优点成为原油污染治理方法的主流［2－4］。由于不同的微生物对不同的成分降解效果不同，因此利用混合菌群的协同作用会起到更好的效果［5］。Komukai-Nakamura等［6］使用复合菌株对原油进行降解研究，发现复合菌剂的降解效果明显高于单一菌株。但目前所筛选的原油降解微生物绝大多数是细菌与酵母菌［7］，由于这类微生物必须有一定浓度的污染物才可能诱导合成所需的酶，对不良环境适应性差且不易保存，因而不易在原油污染现场使用。白腐真菌由于其独特的非专一性降解有机污染物的特点，而越来越受到国内外研究者的重视，但目前针对白腐真菌的研究大都是研究单一白腐真菌对污染物的降解。本实验是在前期研究筛选出的最佳协同作用的复合菌株基础上，研究复合菌剂对人工模拟污染土壤中原油降解效果。因此本研究为开发和利用我国东北土著白腐真菌治理原油污染土壤提供可靠的理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌种来源

本试验所用微生物菌由实验得出的3种高效复合菌株:青顶拟多孔菌、糙皮侧耳菌和偏肿拟栓菌。

1.1.2主要培养基

固体培养基:土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，KH2PO43.0g/L，MgSO41.5g/L，定容至1L，自然pH(用于白腐真菌的扩大培养)。液体培养基:麸皮20g/L，氯化铵0.44g/L，KH2PO40.2g/L，MgSO40.05g/L，CaCl20.01g/L，吐温801.0g/L，无机溶液1mL/L，维生素溶液0.5mL/L，自然pH。

1.1.3主要试剂

试剂:取自大庆原油油田的原油、93#汽油。仪器:SPX－150B型生化恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)、SW－CJ－1D型单人净化工作台(苏州净化设备有限公司)、752型紫外－可见光度计(上海菁华科技仪器有限公司)、MSX－280型手提式压力蒸汽消毒器(北京市永光日月医疗仪器厂)、HZQ－X100振荡培养箱(中国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)、电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.1.4原油污染土壤

实验用土为人工配制的原油污染土壤，土壤采集于东北林业大学林场，原油由大庆油田提供。配置得到4.8%的原油污染土壤。

1.1.5菌剂制备

采用液体培养基，在28℃、120r/min条件下，摇床培养，取对数生长期中期(第9d)，将载体装入瓶中进行高压灭菌，冷却至室温，将混合菌丝团吸附于载体上制备成菌剂。

1.2测定方法

1.2.1土壤中含油量测定

土壤中含油量按紫外分光光计法［8］测定。

1.2.3土壤中pH值的测定

称取混匀后的土壤样品5g与25mL煮沸放凉的去离子水溶液搅拌混匀，放置1h，以PHS－2型酸度计测定pH值。

1.3试验设计

菌剂的接种量分别为1g、2g、3g。加水量为每10d添加50mL蒸馏水。

2结果与分析

2.1不同接种量对原油的降解研究

微生物对原油污染物代谢的生理过程一般通过接触并吸附原油，同时微生物分泌胞外酶通过氧化酶对原油的氧化降解［9］。原油污染物的吸收及胞内代谢与地质环境相结合完成。以微观效应改变宏观环境，利用微生物和地质环境相结合、相互作用、相互依存和调控等进行进一步改善。在定期添加蒸馏水的条件下，向污染土壤分别接种含有菌丝1g、2g和3g的复合菌剂，定期测定石油的降解率。从图1可以看出，第20d的降解率分别为26.86%、32.34%和33.43%，第40d的降解率分别为34.90%、37.42%和38.18%，第100d降解率分别为41.86%、42.37%和43.00%;由于微生物菌剂投加越多，微生物分泌氧化酶越多，因此投加含有菌丝3g的复合菌剂对原油的降解效果最好，所以微生物的数量同样是影响原油降解效率的重要因素［10－11］。

2.2土壤湿度对原油残余量的影响

2.2.1添加蒸馏水条件下复合菌剂降解效果

微生物的生长、胞外酶的分泌是降解污染土壤的关键。研究证实微生物的生命活性很大程度上依赖于环境中的水分和氧气［12－13］。向污染土壤中投加含有菌丝3g的复合菌剂，每隔10d添加蒸馏水50mL，定期测定原油残余量。由表1可以看出到第20d原油残余量明显下降，随之变化不大，这与郭超［14］研究的结论相似。在添加蒸馏水的情况下，初始的原油含量为49.565g/kg，随着菌剂的加入，前20d原油减少了16.571g/kg，前40d原油减少了18.925g/kg，前100d原油减少了21.316g/kg，可见前20d的原油快速降解，随着时间的增加，石油的降解速率逐渐降低。随着水分的蒸发、微生物的利用，水分的含量成明显的下降趋势，在第20d之前，复合菌剂降解效率好，对原油的去除起到了明显的效果，随之活性降低，去除效果缓慢。

2.2.2不加蒸馏水条件下复合菌剂降解效果

向污染土壤中投加含有菌丝3g的复合菌剂，在不添加蒸馏水的情况下，定期测定原油残余量，原油残余量见表1.可以看出到20d原油减少了7.809g/kg，到第40d原油减少了15.79g/kg，到100d原油减少了18.823g/kg。随着土壤中原有的水分被吸收利用，在不添加任何营养物质和水分的情况下，前20d降解效果显著。由表1可见在不添加蒸馏水的情况下，前15d水分流失很快，直到第20d水分流失才出现缓慢趋势，导致微生物菌剂出现或者延长了适应期的时间，随着水分的蒸发、菌丝的吸收利用，总体看出菌丝越多，含水率越低，由于青顶拟多孔菌+糙皮侧耳菌+偏肿拟栓菌的复合菌生长中存在一定的适应期，在营养不充足的环境下，适应期会有所延长，随着时间的增加，本身含有的水分也在挥发和被竞争利用中消耗，得出水含量的多少对微生物分泌胞外酶去除污染物起到一定的作用。

2.2.3不同土壤水分下复合菌剂降解效果比较分析

对照表1可知，在相同的时间内，添加蒸馏水比不添加蒸馏水原油残余量低，到第100d时石油的残余量添加蒸馏水比不添加蒸馏水减少了2.493g/kg，可见保持一定的土壤湿度有利于复合菌剂对石油的降解。由于添加水能提高氧的含量，氧含量的多少直接影响微生物细胞内酶的活性和呼吸作用，控制着微生物的生长和对原油烃类物质的去除能力，间断性的翻耕土壤也能使空气进入土壤，增加土壤的含氧量，使得添加蒸馏水比不添加蒸馏水的原油残余量低;定期添加蒸馏水比不添加蒸馏水相对稳定，更加体现了增加水分和含氧量可以促使微生物分泌胞外酶，加快污染物的去除。

2.3修复过程中pH值的变化对原油污染土壤的研究

微生物在降解原油污染物的过程中，产生一定量的有机酸加快对原油的降解效果，然而过酸的环境也会抑制微生物的生长，最佳的pH环境利于微生物更好的发挥效果，一般认为pH值在6～8之间原油烃的降解效率最高［15－16］。向污染土壤中投加复合菌剂3g，在定期添加蒸馏水的污染土壤中测定酸碱度，结果如图2所示，最初的污染土壤的pH值为5.73，随着微生物菌剂的作用，pH值有所上升，在第20d时pH值为5.77，第100d时pH值为6.23，可见pH增加缓慢，随着菌剂的增多，pH值也有所增加，田苗［17］也证实了在微生物的不断作用下，土壤的pH值降低之后会有所增加。酸碱度持续在5～7之间，不会使酶的空间结构改变，更不会引起酶的活性丧失，完全有利于微生物的生长。

3结论

该复合菌剂降解效果十分明显，在定期投加蒸馏水的条件下，投加的菌剂越多，降解效果越好，投加含有菌丝3g的菌剂第20d的降解率33.43%和第100d的43%，高于1g菌剂第20d的降解率26.86%和第100d的41.86%。添加蒸馏水对原油的去除率最为明显，之后缓慢进行;在定期投加蒸馏水的情况下，投加含有菌丝3g的菌剂，前20d原油残余量减少了16.571g/kg，比不加蒸馏水的多了8.762g/kg。最初污染土壤的pH值为5.73，随着复合微生物菌剂的作用，相同环境下菌剂越多，pH值越高。在100d的实验中pH一直在5.8～6.2之间，属于微酸性环境，此环境利于微生物生长。