土壤As转化及环境行为探究

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本文作者：吴锡1,2许丽英1张雪霞1宋雨1,2王新1贾永锋1作者单位：1.中国科学院沈阳应用生态研究所污染生态与环境工程重点实验室2.中国科学院研究生院

砷污染是一个全球性的环境问题［1～3］，由于自然因素和人为因素的影响，土壤、地下水和地表水等环境的砷污染严重危害人类的健康和生态环境［2～4］．据调查，我国重金属污染的耕地面积达2000万hm2，约占我国耕地总面积的1/5，许多城市和工矿区的土壤都受到不同程度的砷污染［5］，对我国的食品安全、环境质量和人们的健康构成严重威胁［6～11］．砷的毒性与生物有效性在很大程度上由砷的赋存形态决定，而砷的形态转化直接关系到砷的环境行为及其环境效应．通常土壤中的砷主要包括As(Ⅴ)和As(Ⅲ)这2种形态，二者可因环境条件改变或在环境微生物作用下相互转化［12，13］．土壤微生物对砷的还原作用可以直接或间接地影响其赋存形态与环境行为．在土壤中砷大部分与铁、锰、铝氧化物矿物、黏土矿物及腐殖质等结合，不同形态的砷与矿物的亲和力有所区别，当五价砷被还原为三价砷后，土壤矿物对其吸持能力明显降低，可引起砷的活化和释放［14～16］．另一方面矿物中铁的氧化物或氢氧化物矿物是固定砷最重要的基质，微生物对铁的形态转化同样是影响砷的形态与环境行为的关键因素．国内外已有大量研究证实微生物对砷和铁的还原作用强烈地影响土壤中砷的赋存形态与环境行为．例如，Vaxevanidou［17］和Wang［18］等发现土壤中砷的环境行为是由微生物对铁和砷的还原作用共同调控，微生物引起的铁的还原性溶解驱动了砷的释放行为．在微生物对砷的活化与释放过程中，硫酸盐还原过程是调控砷的另一重要因素，硫酸盐还原产物H2S可直接或间接地影响砷的环境行为及稳定性．一方面，在溶解态硫离子与土壤溶液中亚铁离子沉淀的过程中，游离的砷可以被硫化亚铁吸附或共沉淀;另一方面，水相中的H2S也可以与释放的亚砷酸盐反应沉淀为硫化砷．因此当微生物作用下土壤中的砷、铁、硫同时被还原时，砷的形态转化与环境行为将受到多种物理化学和生物因素的控制，其环境行为机制也更加复杂．尽管国内外学者针对上述砷的地球化学循环的一般性机制和一些砷污染土壤开展了大量研究，并取得了很多重要成果［14～21］，但对于土壤中多元素共同调控下砷的环境行为及其形态转化的微生物学与化学机制仍需要进一步研究．本研究利用清洁土壤负载低剂量砷来模拟砷污染土壤，开展缺氧条件下土壤微生物作用对砷的形态转化与环境行为的影响，并探讨砷释放与固定的机制，旨在为评价砷土壤的环境风险及建立污染修复方法提供依据．

1材料与方法

1.1土壤砷的负载

土壤样品采自沈阳张士污灌区，0～100cm深，样品每20cm为一层，分层装入自封袋，当天带回实验室－4℃冰箱冷冻．土壤消解后测定其中主要元素，如表1所示．其中砷的本底值为10mg•kg－1．采用1∶5的固液比进行砷的负载(6.6mg•L－1的Na3AsO4溶液砷酸钠溶液)，35℃，170r•min－1，避光，平衡24h．4000r•min－1离心10min，倾出上清，并用蒸馏水振荡离心洗涤2次固体，测液相砷的残留浓度，保留固体．负载后，土壤体系砷含量为40mg•kg－1.

1.2细菌的富集培养

基础盐培养基(MSM，g•L－1):KH2PO40.14，NH4Cl0.25，KCl0.5，CaCl2•2H2O0.13，NaCl1.0，MgCl2•6H2O0.62，酵母提取物0.5，乳酸钠2mL•L－1，外加硫源无水Na2SO410mmol•L－1，用1mol•L－1NaOH调节pH为7.0～7.2．向载砷土壤中加入培养基，以1∶20的固液比，在35℃下170r•min－1恒温振荡器中避光培养8d．培养基采用无氧水配制，配制过程氮气保护，将培养基在厌氧手套箱中加入载砷土壤，于厌氧瓶中培养，以保证厌氧条件．用高压灭菌锅将土壤灭菌，作为对照组．非生物对照组实验的固液比、温度等所有培养条件与生物培养组相同．

1.3分析方法

为避免样品氧化，取样与样品处理在厌氧手套箱中进行．样品摇匀后取5mL培养液用0.45μm的滤膜过滤，滤液用于分析溶解态的Fe(Ⅱ)、Fe(T)(总铁)、As(Ⅲ)和As(T)(总砷)的浓度．滤后固体用1mol•L－1HCl170r•min－1振荡提取2h，4000r•min－1离心10min，上清液用于分析HCl提取态的Fe(Ⅱ)、Fe(T)(总铁)、As(Ⅲ)和As(T)(总砷)的含量．另取土壤培养液5mL，加入5mL6mol•L－1HCl，170r•min－1提取5d，分析不同层土壤酸挥发态的S(即AVS)［23］．其中Fe(Ⅱ)和AVS立即进行厌氧显色并测定，而用于测定As(Ⅲ)的样品用0.4mol•L－1的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(pH4.5)1∶1稀释后在冰箱中保存48h内测定．砷的形态测定［22］:As(Ⅲ)和As(T)浓度测定采用原子荧光光谱仪(AFS-2202，北京海光公司)进行．其中As(Ⅲ)样品先用0.4mol•L－1的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(pH4.5)作为样品稀释液和载液;As(T)的样品中加入10%体积的预还原剂(含5%硫脲和5%抗坏血酸的混合溶液)，用5%HCl定容，反应数小时后用原子荧光光谱仪测定As(T)．As(T)与As(Ⅲ)的差值即为体系中As(Ⅴ)的浓度．总铁Fe(T)采用原子吸收光谱法分析［22］，亚铁离子采用邻菲啰啉分光光度法［22］，S2－离子采用亚甲基蓝比色法测定［23］．

2结果与讨论

2.1微生物作用下砷的释放

在微生物作用下无外加硫的培养体系中各层土壤均见明显的砷还原与释放，但不同深度土壤砷的释放程度有所不同，如图1．20～40cm深度土壤砷的释放量明显高于其它层土壤，As(Ⅲ)和As(T)分别达到892.8μg•L－1和1240.6μg•L－1，与对照组相比，分别增加了856.7μg•L－1和995.2μg•L－1，在不同深度土壤的培养体系，液相中超过70%的砷是以As(Ⅲ)形式存在，非生物对照中几乎没有亚砷酸盐．可见是微生物的作用造成土壤中砷的释放．在外加硫体系中，溶解态的As(Ⅲ)和As(T)较无外加硫体系均明显降低，其中20～40cm深度土壤As(Ⅲ)和As(T)分别降低了499.6μg•L－1和676.2μg•L－1，降低幅度最大，而在60cm以下深度土壤的培养组中，砷的释放量变化都不大，As(Ⅲ)和As(T)释放大约减少300μg•L－1和160μg•L－1，说明土壤中微生物的数量和活性强烈的影响体系中硫酸盐的还原过程以及砷的环境行为．与深层土相比，表层土中的微生物在数量和活性都占有优势，表土中补加硫酸盐后明显抑制了砷的释放行为．体系中补充适量的硫酸盐可以大大抑制了砷的释放行为，在硫酸盐微生物作用下体系中硫酸盐还原产物-硫离子可通过产生铁的硫化物以吸附或共沉淀方式重新固定被释放的砷，或者直接产生砷的硫化物沉淀，使被释放的砷再次被固化，回到固相中．从图1可以看出非生物对照组中也有部分溶解态砷释放，但大多以As(Ⅴ)形式存在，几乎没有As(Ⅲ)释放，只有无硫培养体系中少量的As(Ⅲ)，可能是原有土壤中存在的少量As(Ⅲ)被释放出来．这可能由于培养基中的乳酸盐对砷具有一定的解吸附作用，—COOH与As(Ⅴ)竞争吸附后位点，造成砷有一定量的释放［24］．尽管培养液本身也可引起固相少量的砷溶解，但土壤微生物作用是造成砷的还原与释放的根本因素.

2.2微生物作用下盐酸可提取态砷的形态分析

砷在土壤中的结合形态决定砷的环境效应和生物有效性．盐酸可提取的砷形态主要指盐酸可以溶解的无定形铁锰氧化物、部分结晶度很差的结晶态铁氧化物结合的砷以及酸挥发硫吸附或共沉淀的砷［25］．图2给出了在微生物作用下不同土层固相中盐酸可提取态As的形态与含量情况．从图2中可以看出，与对照培养组相比无论培养体系中是否外加硫酸盐，每层土中盐酸可提取的砷总量都大大降低，而且固相中盐酸提取的As(T)几乎全部转化为As(Ⅲ)．其中在没有外加硫源的体系中，0～20cm表土的培养组中固相中盐酸提取态的砷中As(Ⅲ)升高了约2.2mg•kg－1，但盐酸可提取的As(T)大大减少，As(T)约减少了9.9mg•kg－1．随着深度增加，盐酸提取态As(Ⅲ)和As(T)略有增加．与未加硫的培养体系相比，在外加硫酸盐的培养体系中经过微生物还原后无论是表层土壤还是深层土壤中盐酸可提取的总砷量均进一步降低，其中表土0～20cm盐酸可提取态As(T)约为1.5mg•kg－1，与不加硫的体系相比约降低了50%，约占非生物对照组盐酸可提取砷总量的11.4%，而加硫与未加硫的非生物对照组相比变化不大．由表2中数据可以看出，与未加硫的体系相比加硫体系中液相被释放的砷和固相中盐酸可提取的As(T)的量都大大降低，液相中砷和固相盐酸提取的砷总量减少了16.5%，相当于不加硫生物培养组中释放的砷和盐酸可提取砷总量的37.1%转化为盐酸不可提取的形态，可见在不加硫条件下，微生物还原作用造成了砷被还原、活化和释放，而外源硫的加入促使微生物还原/活化的砷转化成更加稳定的形态．在前期研究中发现微生物的还原作用可以将砷转化为稳定的矿物形式固定下来，如砷还原菌Desulfotomaculumauripigmentum能够将体系中的As(Ⅴ)和硫酸盐同时还原形成As2S3沉淀，因此增加砷的稳定性［26］．而Kirk等［27］的研究也发现硫酸盐还原菌可通过生成硫化物固持砷．同时在长期的培养过程中新生的和老化的硫化亚铁或者次生的黄铁矿等都是具有较强的固砷能力［28，29］．因此，砷的形态可伴随着体系中其它元素的形态转化而转化，在本研究中也发现硫酸盐还原过程促进砷转化为更稳定的盐酸不可提取态，可能与新生的矿物黄铁矿相结合，或者被转化为砷的硫化物．

2.3微生物作用下铁的形态转化

在本研究中，微生物的还原作用不仅引起砷的形态转化，同时微生物作用下铁的还原和释放，以及相伴随的硫酸盐还原过程强烈的影响着砷的环境行为．图3给出了微生物作用下铁的形态转化，并采用盐酸提取土壤中的无定形铁氧化物和弱结晶度的结晶态铁氧化物以及酸挥发性硫化物中的铁，研究固相中铁的形态转化与砷的环境行为的关联．由图3可知，未加外源硫的培养体系中，各层土壤铁的释放量有所不同，大部分释放的铁都以还原态的Fe(Ⅱ)形式存在，而非生物对照组中几乎没有溶解态Fe(Ⅱ)存在，可见体系中微生物还原作用引起了土壤矿物中铁的还原性溶解．在微生物作用下固相中盐酸可提取的总铁量大大增加，其中在表层0～20cm土壤盐酸提取态的Fe(Ⅱ)和Fe(T)分别增加了约4956.0mg•kg－1和2248.0mg•kg－1，还原态的亚铁离子约占盐酸可提取态总铁的50%．而且与非生物对照组相比较各层土壤中盐酸提取态总铁的量大约都增加了30%，说明微生物的作用造成土壤固相中的铁的活化．当外加硫酸盐后，体系中溶解态的亚铁离子大大降低．与不添加硫酸盐的培养组相比，表层0～20cm土壤的培养组溶解态的Fe(Ⅱ)从40.0mg•L－1降低到0.4mg•L－1，深层60～80cm土培养组中溶解态Fe(Ⅱ)从50.1mg•L－1降低到1.1mg•L－1．可见添加硫酸盐后液相中亚铁离子的释放过程大大降低，微生物作用下的还原产生的Fe(Ⅱ)与硫酸盐的还原产生的硫离子结合沉淀进入固相．在微生物作用下培养8d后无论哪一层土中盐酸可提取的总铁量进一步大大增加，是非生物对照组盐酸可提取铁量的2～3倍．同时，添加与未添加硫酸盐的培养组相比，表层0～20cm土中盐酸可提取的总铁含量增加最多，从9036.0mg•kg－1增加到15996.7mg•kg－1．这部分亚铁的增长主要是来自于液相中被硫离子沉淀下来的Fe(Ⅱ)，说明通过添加硫酸盐可以促进体系中被释放的铁的再固定过程，减少固相的铁流失．固相中盐酸提取的亚铁离子中可能包括土壤中原有的极少量亚铁矿物中的亚铁，微生物直接催化铁还原产生的亚铁离子与体系中硫酸盐的还原产物硫化氢发生沉淀而固定下来的亚铁，以及硫化氢所参与固相中铁的还原产生的亚铁［30］．本研究中培养8d后的体系中，无硫体系中硫离子(浓度约为335.3μg•L－1)与亚铁离子的离子积KIAP(约为7.6×10－9)远远大于硫化亚铁的容度积Ksp(约为1.59×10－19)．因此可以确定体系中产生了硫化亚铁，砷可以被新生的硫化亚铁以吸附、包裹、沉淀或共沉淀等途径固持．不过从盐酸可提取的总铁数据中可以看出，亚铁所占的比例大约在50%左右，体系中还有较多高铁矿物，体系中还原产生的亚铁离子可以再次被吸附到铁氧化物表面，因此体系中应存在部分的Fe3O4，新生的Fe3O4也可以结合部分的砷．一些学者研究认为［28，29］，新生的硫化亚铁矿物在培养过程中会逐渐老化生成黄铁矿(FeS2)，作为盐酸不可提取的形态之一，黄铁矿所固定的砷的形态更加稳定．不过硫化亚铁向黄铁矿转化过程比较慢，在本研究培养的8d内即使形成了黄铁矿，它的比例也非常低，因此在盐酸不能提取的砷中，黄铁矿结合的砷不会是主要形态，这部分砷的赋存形态很可能是主要以硫化物的形式存在．

2.4微生物作用下硫酸盐还原与砷、铁的环境行为的关联

在天然混合微生物群的作用下，除了发生砷酸盐还原过程外，通常也伴随着铁和硫的还原过程．硫酸盐还原作用下产生的硫化氢可与体系中产生的亚铁离子或亚砷酸盐离子相结合，产生铁的硫化物或砷的硫化物．形成硫化亚铁沉淀时可以同时沉淀或共沉淀体系中释放的砷酸盐和亚砷酸盐．这一过程在地下水或河流沉积物中多有发生，因此硫化亚铁等酸挥发硫化物对固持重金属离子具有很重要的作用［31，32］．本研究采用盐酸提取酸挥发性的硫化物，研究硫化物与砷的环境行为的关联．图4给出了在缺氧培养的8d内体系中硫酸盐的还原与硫化物的产量变化情况．从图4可以看出，不同土层酸挥发硫的产量有所不同．可能由于表层土壤中有机质含量较高，因此无论是否外加硫酸盐表土0～20cm土的培养组中AVS产量总是比其他土壤层的产量高很多．在未加硫酸盐的培养体系中，酸挥发硫的产量都在2.5mg•kg－1以下，在外加10mmol•L－1的硫酸盐后每层土壤的培养物中盐酸AVS的量都超过200mg•kg－1．对于其他几层的土壤而言，外加的硫酸盐也大大促进了体系中硫化物的产量．图4与图2和图3比较可以看出，盐酸提取态的Fe(Ⅱ)与各土层AVS变化趋势成正相关，硫化亚铁是固相中盐酸可提取的亚铁离子的主要以形态．而在酸挥发硫或者说硫化亚铁含量较高的培养组中盐酸可提取的砷的量较低，二者呈负相关．体系产生的酸挥发硫越多，砷的释放越少．可见土壤中原有的硫酸盐含量不足，当外源提供足够的硫酸盐条件下微生物的作用硫酸盐还原更见明显，可以在很大程度上促进砷的固定．特别是微生物丰富的表层土中，加硫培养促进了体系中释放的和盐酸提取态的砷大大降低，以降低的总量计算相当于无硫体系中释放的和盐酸可提取的砷总和的37.1%的砷再次被转化为盐酸不能提取的稳定的形态．体系中硫离子和亚砷酸盐在液相中的浓度及其离子浓度积，可作为判断产生硫化物的依据．例如在表土0～20cm的不加硫的生物培养体系中，培养8d后体系中硫离子与三价砷的平衡浓度分别为335.3μg•L－1和562.2μg•L－1，而加硫的体系中硫离子与三价砷的平衡浓度69.85mg•L－1和318.9μg•L－1，根据液相中S－2及As(Ⅲ)的平衡浓度进行估算，不加硫系统的lgKIAP约为－25.2，加硫体系中lgKIAP-S约为－18.7，无论那个体系培养8d后三价砷及硫离子的离子积的lgKIAP都大于lgKSP(约为－46.22［33］，其中KIAP表示液相中三价砷与硫离子的离子积，KSP表示As2S3的容度积)，说明无论是否补加硫酸盐，体系中产生了As2S3沉淀．不过由于土壤中矿物成分太复杂，新生矿物的含量相对较低，目前还没有更直接的光波谱数据加以证实，这部分仍有进行待进一步的表征和研究．

3结论

(1)在张士污灌区的土壤中，土著微生物具有较强的砷、铁和硫的还原能力．(2)微生物对铁和硫的还原作用及其还原产物共同调控砷的环境行为，在不加硫条件下，微生物对铁氧化物的还原性溶解造成了砷的活化和释放，补加硫酸盐可以抑制砷的释放过程，使已活化的砷再次被固持．(3)在硫酸盐还原作用下形成非常稳定的硫化物矿物As2S3是土壤微生物固定砷的主要途径．