剖析葡萄酒酒香酵母属
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1904年由HJELTECLAUSSEH在葡萄酒不良风味的研究中首次提出了酒香酵母属（Brettanomyces）这类微生物[4]。随着研究人员在葡萄酒的研究中发现了越来越多酒香酵母属的种，著名的是VanderWalt和VanderKerken发现酒香酵母属中的2种Brettanomycesbruxellensis和Bret-tanomycesintermedius具有产生子囊孢子的形式。最终在1964年被Walt提出一种具有产子囊孢子形式的酒香酵母属，也被称为德克酵母属（Dekkera）[5]。酒香酵母属常被称为一种败坏酵母，但是在葛有辉等[6]中描述了酒香酵母属的产香机理，这说明酒香酵母属对葡萄酒的香气形成有密切关系。酒香酵母属中的糖苷酶可以把用于发酵酿造的原材料中存在有结合态糖苷键形式的风味前体化合物分解，释放出具有挥发性的香气成分，增加了酒的香气[6]。但是在葡萄酒酿造过程中，其酒香酵母属代谢产物不单单指这些香气成分，同时在酒体产生了以4-乙基苯酚（4-Ethylphenol，4-EP）和4-乙基愈创木酚（4-Ethylguaiacol，4-EG）的风味特征为典型代表的一类不良风味。4-EP和4-EG的风味特征是塑料燃烧味、草药味、马厩味等[7]。由挥发酚和某些脂肪酸等共同作用形成的一种特殊的风味，形成了酒香酵母属的风味特征，这就增加了葡萄酒风味特征的复杂性。
一份葡萄牙人的研究表明来自不同国家的葡萄酒中，超过25%的红葡萄酒中的4-EP的含量超过人的嗜好阈值620μg/mL，高于这一阈值时一些消费者会拒绝饮用该产品[8-9]。酒香酵母属的代谢产物经化学分析得出的数据是可靠，但是用感官评定来评定这些代谢产物大部分是不确定的。例如，CHATONNETP等[10]报道了红酒中4-EP和4-EG的觉察阈值分别为605μg/mL和100μg/mL。当这两种物质在红酒中并存时，4-EP的觉察阈值会降低，加上不同的葡萄酒就有不同的阈值，从而很难定义这些阈值。一般来说，酒香酵母属产生的代谢产物的风味强度，个人的嗜好阈值和饮食习惯将决定了人们对酒香酵母属诱导的风味的可接受性。
2酒香酵母属的生理特征
CONTERNOL等[11]研究了在葡萄酒中B.bruxellensis菌株的遗传与生理特征得知，选葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖和海藻糖分别作为碳源，大部分的酒香酵母属菌株是可以生长的。但是其他糖类如阿拉伯糖、乳糖和棉子糖分别作为碳源，大部分的酒香酵母属菌株是呈现不生长的状态。同样在糖醇类核糖醇、甘油、甘露醇的条件下，大部分的酒香酵母属菌株也是呈现不生长的状态。很少的酒香酵母属菌株能生长在乳酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸等有机酸的条件下。有报道称，乙醇作为唯一碳源大约有25%的酒香酵母属菌株可以生长的，而不到10%的菌株可生长在可溶性淀粉中。所有的菌株能够生长在纤维素或酒石酸作为唯一碳源的条件下。所有的菌株也可以使用精氨酸和脯氨酸作为碳源。研究发现生物素和维生素B1是所有菌株生长的必需营养成分[12]。脯氨酸，精氨酸都可以作为所有酒香酵母菌属的氮源，硝酸盐可以作为大多数的菌株在生长测试中作为唯一氮源。酒香酵母属有较高的产醋酸能力，能耐较高的酒精度，甚至在14%~14.5%的酒精浓度下也可继续生长繁殖。虽然其发酵能力较弱，但产生的酒精量不少[13]。酒香酵母属菌株在pH值为2.5条件下都能生长，在pH值为2.0时，其中的94%能生长。多于1/3的菌株能在37℃中生长，低于1/3的菌株能在10℃中生长，在10℃和37℃之间的条件下，酒香酵母属菌株却很少能生长繁殖[11]。在葡萄酒酿造过程中，酒香酵母属极易产生以4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚为典型的风味特征的一类不良风味，是葡萄酒感官品质的重要影响因素，4-乙基苯酚的风味特征为多酚/草药味，而4-乙基愈创木酚的风味特征多为丁香/假日香料味[14]，4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚的浓度和两者之间比例对葡萄酒的风味有着重要影响，两者之间细微的差异也能被感官评价小组或者消费者所察觉。
3葡萄酒易受酒香酵母菌属污染的原因
从葡萄园到葡萄酒灌装各个环节中都极易受到酒香酵母属的污染。一是葡萄园管理上不佳，容易受到酒香酵母属的侵袭。二是在葡萄酒酿造过程中，如酿酒设备的清洗和杀菌不够彻底，或者使用已经被酒香酵母属污染的酒桶，那酒香酵母属就可存在于葡萄酒酿造的各个阶段。目前，[15]。其中Bret-tanomycesbruxellensis是瓶装酒中引起葡萄酒风味劣变的关键微生物。这是由于布鲁塞尔酒香酵母对酒精有较高的耐受力，据统计，Brettanomycesbruxellensis在葡萄酒中能耐酒精度高达14%~14.5%[16]。在容许有较低糖分的条件下，它在酒精发酵的整个过程中都能生长，通过产生乙酸减缓酵母属菌的生长[17]，最后会压倒且替代了发酵主力微生物酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）[18]。三是如果葡萄酒长时间陈化，尤其是高品质的葡萄酒，易受酒香酵母属感染，这是B.bruxellensis的生长特征缓慢导致的结果。四是酒体有较低的酸度、高含量的多酚化合物给酒香酵母菌属生长繁殖提供了良好的环境，还有橡木桶的老化同样是其生长繁殖的好环境。
4酒香酵母属不良风味抑制方法的研究进展
有关酒香酵母属所产生不良风味的研究已成为世界性的课题[19]，酒香酵母属的风味特征是影响世界上葡萄酒生产的各个区域，很多研究者认为抑制酒香酵母属不良风味的研究是现代急需解决的课题，这对减少世界范围内葡萄酒产业不良风味的产生，降低葡萄酒产业的经济严重损失具有特殊的意义[20]。目前，综合国内外文献报道，在葡萄酒酿造的整个过程中，原料、设备的选择，酒曲、酒精度、酸的含量、温度、氧容量等都可以考虑为抑制葡萄酒不良风味产生的因素[21]，以及外加如二氧化硫、焦糖酸二甲酯（VelcorinTM）等都可作为其抑制试剂。本文分别从这些因素和外加试剂来综述抑制酒香酵母属不良风味的方法。尽管这些方法不能完全消除酒香酵母属不良风味物质，但是可以减少其不良风味物质的浓度，从而减少酒香酵母属不良风味对酿酒工业的不利影响。
4.1抑制酒香酵母属不良风味的因素
4.1.1原料、设备的选择B.bruxellensis主要被发现于葡萄的表皮、陈酿的橡木桶以及葡萄酒中。因此灭菌法是抑制葡萄酒中不良风味的第一步。从葡萄园到灌装的整个环节都有抑制不良风味物质的考虑因素。第一葡萄不要选腐烂葡萄，因为腐烂葡萄酒上已经被酒香酵母属酵母菌感染了，即使杀菌也不能彻底消灭它，有研究者发现酒香酵母属酵母菌在含酸量高的条件下不能生长，所以可选用较酸的葡萄作为原料。第二酿酒设备需要彻底的清洗和杀菌，最重要的是不能使用已被污染的酒桶。据研究者发现，酒香酵母属能穿透酒桶深度达到8mm处生长并且繁殖[22]，一旦酒桶被B.bruxellensis感染上，即使清洗、杀菌甚至削桶或者其他的技术方法都不能将酒香酵母属酵母菌从酒桶中彻底消除[23]，例如，已被酒香酵母属污染的酒桶用臭氧处理，也是只能可以延迟B.bruxellensis的生长而不是彻底消除它[24]。
4.1.2氧气和湿度葡萄酒酿制过程中都可以为B.bruxellensis的生长提供良好的条件，尤其是发酵时期。研究发现，葡萄酒中的酒香酵母属代谢产物4-乙基苯酚和4-乙基愈创木酚与酒体中氧容量呈正相关，而与地窖湿度呈负相关[25-26]。这是因为氧气能促进B.bruxellensis的生长，而湿度大都抑制酒香酵母属酵母菌的生长可能是因为酒桶中的酒缺乏蒸发，减少了酒与氧气的接触面积。目前，国内外大部分葡萄酒工业在葡萄酒生产工艺的整个流程中都采取相应的措施来降低氧气的浓度。研究发现，在葡萄破碎、果汁分离、过滤等工艺都要避免与空气的接触，尤其是在葡萄酒陈酿过程中采用了氮气排除酒体中氧气的生产工艺，从而降低了酒体中的氧容量，在瓶装工艺中采用酒桶平仓装酒，同时要注意湿度应设为55%，这样有利于减少酒与氧气的接触面积，从而抑制B.bruxellensis的生长。在产品储存的环境湿度应为70%[27]。平仓装酒、用氮气排氧等工艺技术都是比较成熟的。
4.1.3酒精度与酸的含量据发现，提高酒体中的酒精度可以抑制风味前提物质的产生，但是，B.bruxellensis能耐较高的酒精度，甚至在14%vol~14.5%vol的酒精度下能生长繁殖，但是也要考虑到酵母菌的活力与酒精度的耐受性密切相关[28]。不管在酵母菌的活力上受到限制，还是考虑到酒精度太高对葡萄酒风味的影响，只从单方面的提高酒体的酒精度来抑制酒香酵母属的生长和繁殖是不行的。因此，在葡萄酒生产工艺上是极少用到这个方法的。在酿酒过程中，选用含酸量较高的葡萄或者加入弱酸等方法可以抑制B.bruxel-lensis的生长，例如，山梨酸可以作为抑制风味前提物质生产的抑制剂，但是B.bruxellensis酒香酵母属对山梨酸抑制有较强的抗性。因此，葡萄酒酿酒师应该必须清楚其最合适的添加量[29]。但也有一些研究认为抑制B.bruxellensis的生长与酒体中的含酸量无关[30]。因此，单利用这些方法去抑制不良风味产生的葡萄酒企业是很少的。
4.1.4温度据研究发现，多于1/3的酒香酵母属菌株能在37℃中生长，低于1/3的菌株能在10℃中生长，在10℃和37℃之间的条件下，酒香酵母属菌株却都很少能生长繁殖[11]。从这个角度考虑，葡萄酒酿制过程的温度应控制在10℃~37℃之间，但是也要考虑酿酒酵母发酵温度，葡萄酒的发酵温度一般在20℃至30℃之间，并且要保持稳定发酵温度在这个范围内，才能使酒发酵的状态最佳。因此，葡萄酒产业在葡萄酒发酵工艺上采用自动制冷系统控制发酵温度在20℃~30℃范围内，不仅使酒发酵最佳，而且能有效的控制酒香酵母属不良风味的产生。在陈酿过程中应保持在10℃~12℃，产品储存应在12℃~15℃，这两个温度范围都能有效抑制酒香酵母属生长和繁殖[11，27]。葡萄酒酿制过程中的制冷系统技术是很成熟的。
4.2外加试剂减少酒香酵母属不良风味
4.2.1二氧化硫布鲁塞尔酒香酵母（B.bruxellensis）可存在于葡萄酒酿造的各个阶段，如酒精发酵、乳酸发酵时期等[31]。有研究者发现，向发酵罐中加入足量的二氧化硫并且在发酵过程中维持一定的浓度，可以抑制B.bruxellensis有害微生物的生长。这是因为有一定浓度的二氧化硫可以使B.brux-ellensis进入一种存活但不繁殖的状态[32-33]。如果在陈酿的过程中把剩下的二氧化硫排空的话，这些有害酵母菌仍存活在酒体中继续生长繁殖[34]。因此，在葡萄酒整个酿制过程中，在发酵罐中应加入二氧化硫并保持一定的浓度。研究发现，除了酒体中的pH值较高的情况下，一般的酒体中加入的二氧化硫的浓度应在30mg/L以上[35]。因此，在葡萄酒酿制过程加入二氧化硫是减少酒香酵母属不良风味浓度的适合方法。
4.2.2羟基肉桂酸脱羧酶（HCDC）外加相关的酶对酒香酵母属不良风味的抑制也不失一种好方法。例如，向富含香豆酸和葡萄花青素的原葡萄汁中加入适量的羟基肉桂酸脱羧酶进行发酵，目的是为了生成更多的苯乙烯基吡喃花青素产物[36]。因为此产物可以使葡萄酒色泽稳定和降低4-EP和4-EG的形成，从而降低4-EP和4-EG的浓度[37]。
4.2.3焦糖酸二甲酯（VelcorinTM）酒体中含有一定的糖分或者酒不要过滤处理，常可以加入焦糖酸二甲酯（VelcorinTM）进行酒的保藏。这是由于焦糖酸二甲酯（VelcorinTM）可以使B.bruxellensis失活，而其他酿酒酵母可能会在酒中启动再发酵过程。减少不良风味物质的产生，抑制发酵过程中B.bruxel-lensis的生长繁殖，这是抑制风味物质劣变的必要条件。可以从物理化学角度去考虑，比如过滤、蛋白质澄清酒体，虽说过滤和澄清通常被认为对酒的品质上是不利的，但是这些处理酒体可以减少B.bruxellensis的水平[38]。这些方法虽然都不能消除B.bruxellensis产生的不良风味物质，但是可以降低其浓度达到人们可以接受的水平。目前最有效的方法是这些方法的综合而不是单一使用。例如，首先对设备、原材料进行清洗和杀菌，最好不用已经被污染的酒桶，使用适量的二氧化硫，酒桶平仓装酒，使用种子培养基可以减少内源性发酵，从而减少B.brux-ellensis生长繁殖的可能性。
5展望
目前，国内对B.bruxellensis不良风味的抑制方法仅有少量文献报道。而酒香酵母属B.bruxellensis对葡萄酒的污染是普遍的世界性的问题，易受到B.bruxellensis的感染主要原因是其较低的酸度和高含量的多酚化合物及橡木桶的老化，还有B.bruxellensis缓慢生长特征使那些高品质的葡萄酒更容易受到其污染。因此，B.bruxellensis的存在使葡萄酒工业面临着严重的经济损失。通过本论文的综述，对国内葡萄酒工业由酒香酵母属不良风味的抑制有所借鉴，从而降低葡萄酒工业的成本，满足国内人们对葡萄酒日益增加的需求，提高了我国葡萄酒在国际市场的竞争力。但是目前国内外抑制方法的研究并不系统化，而且还有存在一些有待进一步检验的结论，例如，抑制B.brux-ellensis的生长与酒体中的含酸量是否相关等，还有对不良风味较成熟的抑制方法更加优化还需要努力去研究。
作者:林文华游雪燕冯涛单位:上海应用技术学院香料香精技术与工程学院上海应用技术学院工程创新学院
