探索组织工程与干细胞的进展
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组织工程学概况组织工程学是根据细胞生物学、材料科学和生物工程学的原理，构建生物替代物以维持、修复损伤组织和器官功能的一门科学。
组织工程的治疗策略通常分为两类:①利用脱细胞基质(acellularmatrixgraft，ACMG)，为新组织生长提供正确定位、定向，依靠机体自身的再生能力促进组织再生。脱细胞基质通常是应用机械和化学的方法去除组织中细胞成分后的富含胶原的基质。②利用接种细胞的脱细胞基质构建新的组织器官。
组织工程尿道重建的基础研究应用ACMG修复尿道缺损的研究已有多年，包括尿道细胞外基质(urethralextracellularmatrix，UECM)、膀胱黏膜下层(bladderacellularmatrixgraft，BAMG)、小肠黏膜下层(smallintestinesubmucosa，SIS)等，它们经过脱细胞处理后，仅保留胶原蛋白、蛋白多糖等低抗原性物质。杨嗣星等［3］应用UECM进行兔的尿道缺损修复实验。术后3周，尿路上皮完全覆盖细胞外基质，术后6周，平滑肌细胞再生，炎性细胞消失，术后24周，再生尿道组织与正常尿道组织无区别。Chen等［4］应用猪BAMG修复兔尿道缺损，术后尿路造影显示尿道连续无狭窄，术后2个月BAMG表面覆盖完整的尿路上皮细胞，术后3个月炎性细胞消失，未见瘢痕形成，术后6个月黏膜下肌纤维束基本成形。Nuininga等［5］采用SIS以镶嵌补片方式修复兔的尿道缺损，术后尿道造影显示所有试验动物尿道口径正常无狭窄，术后1个月尿路上皮细胞完整覆盖SIS，炎症细胞浸润，术后3个月炎症细胞消失，平滑肌细胞再生。尽管采用单纯脱细胞基质以补片的方式进行尿道修复已取得较好的效果，但如果尿道损伤较大甚至闭锁，单纯的全管状材料修复，疗效不佳。修复段尿道出现萎缩，尿道黏膜下出现杂乱无序的肌束，尿道造影显示尿道狭窄形成［6］，其原因可能是由于尿道的缺损过长，宿主的滋养血管延伸到缺损中心区域较为困难，缺乏血供的上皮细胞爬行能力减弱，难以覆盖整个创面，并且支架降解较早，宿主的自体细胞尚未完全覆盖其上所致，而将种子细胞接种于管状胶原基质材料修复长段管状化尿道缺损则成为一种更好的选择。DeFilippo等［7］分别用未接种细胞和接种细胞的管状BAMG修复兔尿道缺损，发现单纯用管状基质修复的尿道，重建尿道狭窄并纤维化形成，而接种了自体细胞的管状胶原基质，重建尿道连续无狭窄发生。傅强等［8-9］用植入包皮表皮细胞的BAMG修复管状化尿道缺损，术后3个月修复段尿道已全部被黏膜覆盖，黏膜光滑，管腔无明显狭窄，组织学显示术后修复段尿道上皮呈表皮细胞形态并与宿主尿路上皮存在明显分界线，经长期随访观察发现:术后6～12个月，修复段尿道黏膜出现乳头样结构，与尿路移行上皮细胞较为相似，这表明了在长期尿路环境中，来源包皮的表皮细胞可以向移行上皮形态转化。Gu等［10］应用硅胶管以腹膜腔作为生物反应器构建自身管状尿道修复材料，组织学证实成肌纤维细胞种植于胶原基质，其外有单层间皮细胞。将此修复材料对兔的尿道缺损进行尿道重建，术后尿道造影显示尿道连续无狭窄，此项研究为我们修复管状化尿道缺损提供了新的思路。
组织工程尿道重建的临床研究Atala等［11］采用BAMG修复传统手术治疗失败的尿道下裂，新建尿道长度为5～15cm，术后1年尿道造影显示尿道连续无狭窄，组织学证实重建尿道表现为典型的尿路上皮，术后随访22个月，除1例新建尿道出现阴茎头下瘘管外，其余患者均治愈。EL-Kassaby等［12］用BAMG对28例尿道狭窄患者进行尿道修复，新尿道长1．5～16cm，术前和术后常规行排尿记录、体检、逆行尿路造影、尿流率和膀胱镜检查，术后随访36～48个月，仅有4例患者在吻合部位出现轻度狭窄，其余患者治愈，活检组织学检查显示典型的尿路上皮。Palminteri等［13］应用SIS为20例尿道狭窄患者行尿道重建，17例患者尿道狭窄治愈，术后3个月膀胱镜检显示重建尿道口径正常无狭窄，但支架部位未被尿路上皮完全替代，原因可能是尿路上皮再生完全至少需要20周才能完成。Fiala等［14］用同样材料修复50例尿道狭窄患者，成功率80%，随访期间大部分患者均未出现早期或晚期相关并发症，进一步证实SIS在组织工程尿道重建中的应用前景。Farahat等［15］近来采用内窥镜技术对10例复发性尿道狭窄患者行SIS补片修复，术后8例患者尿道狭窄治愈，仅2例患者表现为轻度的尿道狭窄复发，通过定期行尿道扩张术已获得满意的治疗效果。
目前，口腔黏膜替代已被认为是临床治疗尿道狭窄或下裂一类疾病的金标准［13］，但自体取材可导致张口受限、供体部位麻木感等诸多并发症［16-17］。因而构建组织工程化口腔黏膜是进行尿道重建的一项新选择。Bhargava等［18］将角化细胞、成纤维细胞分别从获取的口腔黏膜表皮层、真皮层分离下来，进行体外培养扩增，达到足够数量后将两种细胞种植在去表皮层的真皮上，构建组织工程化口腔粘膜。将其植入5例患者体内修复尿道狭窄，3名患者目前尿道狭窄治愈，1例因术后阴茎体部纤维化合并阴茎痛性勃起需做全段补片切除，另1例因补片的过度增生及纤维化需做部分补片切除，该研究为组织工程化口腔粘膜的临床应用展现了新的前景。Selim等［19］将角化细胞与成纤维细胞种植在聚乳酸(polylacticacid，PLA)与聚羟基乙酸(polyg-lycolicacid，PGA)的共聚物PLGA(polylactic-co-glycolicacid)上，构建组织工程化口腔黏膜，其机械强度和弹性约为正常口腔黏膜的30%，为PLGA在尿道组织工程中的应用开创了新的前景。2干细胞的研究概况干细胞(stemcells，SC)是一类未分化的细胞，具有自我更新的能力并能进行分化以最终形成成熟的非再生细胞和效应细胞［20-21］。根据分化的不同阶段，主要分为:全能干细胞(受精卵)、多潜能干细胞(胚胎干细胞)、多能干细胞(成体干细胞)、单能干细胞(祖细胞)［22］。目前研究最多的是胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)和成体干细胞(A-dultstemcells)。
干细胞在尿道重建中的基础研究理论上ESCs依靠其多分化能力可作为理想的种子细胞，但获取胚胎干细胞往往造成胚胎的破坏，并且将其植入免疫缺陷动物时，有形成畸胎瘤的风险［23］。Otta-masathien等［24］研究表明在裸鼠的肾被膜下，胚胎干细胞在胚胎膀胱间充质(embryonicbladdermesen-chyme，EBLM)诱导下产生膀胱上皮细胞和平滑肌细胞，并无畸胎瘤的生成。Mauney等［25］应用全反式维甲酸在体外成功将胚胎干细胞诱导成尿路上皮细胞，为胚胎干细胞作为组织工程种子细胞的来源提供了可能性。Frimberger等［26］用种植人胚胎干细胞的猪小肠黏膜下层修复大鼠膀胱缺损，术后28天，膀胱上皮层、粘膜下层和平滑肌层完全再生。成体干细胞来自骨髓、肌组织、血管内皮、皮肤及脂肪等处，可避免获取胚胎干细胞时的伦理问题，同时成体干细胞不会转化为恶性表型，降低了植入体内后形成畸胎瘤的风险，所以研究者们的目光现已逐渐转移到对成体干细胞的研究。Shukla等［27］研究显示骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesen-chymalstemcells)在体外可以成功诱导为平滑肌细胞，但将骨髓间充质干细胞与SIS复合进行猪膀胱扩增替代术时，术后免疫染色和组织化学证实骨髓间充质干细胞在体内并未完全分化为平滑肌细胞，近来已有研究报道骨髓间充质干细胞用于膀胱扩增替代术时可在体内成功分化为平滑肌细胞［28］。因为膀胱构建与尿道重建在生物支架及种子细胞选材上的相似性，因此可借鉴前者指导干细胞在尿道重建上应用。黄红军等［29］用种植骨髓间充质干细胞的脱细胞尿道海绵体-尿道基质(Acellularspongybodyofurethra-urethralmatrix)修复兔海绵体尿道缺损，术后仅1例发生尿瘘，其余排尿通畅。组织学检查:术后2周见少量毛细血管及平滑肌细胞生长，再造尿道腔面完整覆盖单层尿道上皮，术后24周，平滑肌细胞增多，排列规则，尿道黏膜层由七八层上皮细胞构成，尿道腔面光滑、完整。但是，由于骨髓间充质干细胞在骨髓中含量极低，需体外扩增较长时间才能达到构建的细胞数量;同时由于存在着骨髓抽取过程患者较痛苦等问题，使骨髓来源的干细胞在应用中存在较大的局限性。相对而言，脂肪组织来源丰富，只需要简单的吸脂手术即可获得足够数量的脂肪组织，且脂肪组织中脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)含量丰富，仅需要少量的脂肪组织即可获得足够的ADSCs。ADSCs已经证明与骨髓间充质干细胞有相似的多潜能和自我更新能力［30］，可以诱导分化为具有正常收缩舒张功能的平滑肌细胞［31-32］。Brzoska等［33］实验表明脂肪干细胞经体外全反式维甲酸诱导培养可分选出大于80%的上皮细胞，Liu等［34］研究进一步表明，将人ADSCs与尿路上皮细胞混合培养，可以诱导ADSCs向尿路上皮细胞转化。
以上结果表明脂肪干细胞可诱导分化出上皮和平滑肌细胞从而可能作为种子细胞应用于尿道组织工程的修复重建。张亚等［35］应用ADSCs复合多孔丝素膜(poroussilkfibroinscaf-fold，PSFS)修复兔的尿道缺损，术后2周丝素膜结构完整，表面无尿路上皮细胞形成，膜基底部有血管、胶原组织生长，少量淋巴细胞浸润。术后4周丝素膜表面形成3～4层排列欠规则的尿路上皮细胞，黏膜下见大量血管、平滑肌细胞沿丝素膜孔隙生长。术后6周丝素膜表面见排列规则的6～7层尿路上皮细胞，丝素膜被分解成小块状。与单纯应用多孔丝素膜修复尿道缺损相比，ADSCs复合PSFS能加快血管生长、促进尿路上皮及平滑肌细胞生长和加速丝素膜的分解。该研究进一步证实了以干细胞作为种子细胞构建组织工程化尿道是可行的。Wu等［36］应用尿液样本中获取的尿源性干细胞(urine-derivedstemcells，USC)经体外诱导培养传代3次，50%～70%尿源性干细胞分化为平滑肌细胞，超过90%尿源性干细胞分化为尿路上皮细胞。每200ml尿液样本获取的尿源性干细胞在培养传代4次时即可产生至少3．2×108个活性细胞，足以用来构建工程化的尿道组织。
干细胞在尿道重建中的临床展望目前，临床上进行尿道修复较多应用天然或人工的生物支架材料，但如果尿道缺损面积过大乃至闭锁，单纯脱细胞胶原基质的管状修复效果不理想［37］，采用体外预先植入自体上皮细胞的胶原基质进行尿道修复可显著改善这一难题，但往往存在种子细胞选择的问题，干细胞研究为泌尿系组织工程种子细胞开辟了新的途径［38］。尽管干细胞显示出巨大的临床应用前景，但在实际研究中仍存在许多问题:①技术问题，目前干细胞在尿道重建中的研究仅限于实验动物阶段，在干细胞的纯化、诱导方面仍缺乏有效的方法［39］;②伦理学问题，特别是胚胎干细胞的应用常受到社会的强烈反对［40］;③方法问题，对于植入未分化状态的细胞还是分化状态的细胞仍有较大争议。因此如何解决好技术、伦理和方法问题仍将是今后一段时间干细胞临床应用所面临的主要问题。3前景随着再生医学的发展，组织工程和干细胞技术作为再生医学的重要组成部分在许多方面取得了重大进展，为尿道的修复重建提供了新的思路和广阔的前景。临床已成功应用小块的工程化组织修复尿道缺损，但大块的工程化组织却不能尽快建立血液循环，易发生缺血坏死;干细胞的应用进一步拓宽了种子细胞的来源，但存在伦理问题和致瘤性的风险。因此，如何促进组织工程化尿道的血管化以及如何纯化、诱导干细胞可能将是今后研究者们在组织工程尿道重建领域进一步探索的方向。
作者:王营、傅强单位：上海交通大学附属第六人民医院
