少儿AL基因表达研究

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本文作者：赵晓莉潘凯丽钱新宏李迎侠杜莉王英娟罗建峰张垚强欢作者单位：第四军医大学西京医院儿科

分组：(1)alL组32例，男23例，女9例，年龄1．7～14岁，中位年龄4岁。低危10例，中危14例，高危8例。其中B-ALL26例，T-ALL6例。(2)AML组15例，男8例，女7例，年龄2．5～9岁，中位年龄5岁。其中M26例，M35例，M53例，M71例。(3)对照组20例，男12例，女8例，年龄4个月至14岁，中位年龄4岁。其中非恶性血液病骨髓标本5例，门诊体检正常儿童外周血标本15例。样本的采集均征得患儿家长或患儿本人同意。

免疫分型及融合基因检测：所有AL患儿均在初发时采集骨髓液1～1．5mL，用流式细胞仪进行免疫分型，根据白血病细胞表面抗原表达类别分为T-ALL、B-ALL、AML;采集骨髓液3mL进行BCR/ABL融合基因及染色体(9，22)异位的检测，所有AL患儿BCR/ABL融合基因及染色体(9，22)异位的检测呈阴性。

仪器及试剂：基因扩增仪MiniCyclerTM购自MJRESEARCH公司;JS-380全自动数码凝胶成像分析仪购自上海培清科技有限公司。Trizol总RNA提取试剂，cDNA第一链合成试剂盒，2×TaqPCRMasterMix均购自TIANGENBIOTECH公司。

方法：

（1）提取单个核细胞。用常规Ficoll密度梯度离心法分离患儿或对照组骨髓或外周血的单个核细胞，－80℃冰箱冻存，用于总RNA的提取。

（2）RNA提取及定量。取出－80℃冰箱冻存有单个核细胞的EP管，室温自然解冻后，加入1mLTrizol，用漩涡振荡器充分振荡混匀，室温放置5min;每使用1mLTrizol加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min;4℃12000转/分(rpm)离心10min，把水相约600μL转移到新的EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置30min;4℃12000rpm离心10min，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀;加入1mL4℃冰箱预冷的由DEPC稀释的75%乙醇溶液洗涤沉淀，4℃5000rpm离心3min，小心倒出液体，室温放置晾干(约1～2min)，加入30μLRNase-freeddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。取1μL总RNA溶液用RNase-freeddH2O稀释到100倍，用紫外分光光度仪测定总RNA的量，OD260的值在0．1～1．0之间，OD260/280的比值在1．7～2．0之间;取4μL制备好的RNA，在1%的琼脂糖凝胶中电泳，结果有28s、18s、5s三条带。

（3）cDNA的合成。将RNA反转录为cDNA，反应体积为50μL:标本总RNA2μL，随机引物2μL，dNTP2μL，补RNase-freeddH2O定容至14．5μL;70℃加热5min，迅速在冰上冷却2min;加入4μL5×First-StrandBuffer，0．5μLRNasin，再加入1μLTIANScriptM-MLV，充分混匀;EP管置于25℃温浴10min，42℃温浴50min，95℃加热5min终止反应;置冰上用RNase-freeddH2O将反应体系稀释至50μL，－80℃冰箱冻存备用。

（4）引物合成。Notch1和Jagged1基因引物及内参照β-actin基因引物由北京Promega公司合成。见表1。

（5）二步法RT-PCR反应液配制:反应体系25μL，包括反转录的cDNA2～5μL，primer1(10μM)1μL，primer2(10μM)1μL，2×MasterMix12．5μL，补RNase-freeddH2O至25μL。(2)反应条件:Notch1:94℃预变性5min;94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环;最后72℃延伸10min。Jagged1:95℃预变性3min;95℃变性30s，65℃退火45s，72℃延伸45s，40个循环;最后72℃延伸10min。β-actin:94℃预变性3min;94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环;最后72℃延伸10min。

（6）PCR产物分析。取PCR产物5μL，在15g/L琼脂糖凝胶上电泳(80v)，35min后紫外线拍照仪中读取结果。采用RT-PCR检测Notch1基因和Jagged1基因表达的电泳结果，以同时出现目的基因及β-actin基因电泳条带时，判断该标本Notch1基因(或Jagged1基因)表达阳性。以β-actin作为内参照基因，应用GlykoBandscanversion5．0凝胶图像处理软件，读取Notch1/β-actin、Jagged1/β-actin灰度值比值进行半定量检测。

统计学分析：采用SPSS17．0统计软件包进行统计学处理，数据以均数±标准差(x±s)或百分率表示，率的比较采用χ2检验，Fisher确切概率法;多个样本均数比较采用方差分析，多重比较用LSD-t检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

结果

1Notch1基因的表达情况

Notch1基因阳性率:ALL组显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0．05);AML组显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0．05);ALL组与AML组比较差异无统计学意义(P＞0．05)。见表2。Notch1基因表达水平:ALL组及AML组与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0．05);ALL组与AML组比较，差异亦无统计学意义(P＞0．05)。见表2，图1。ALL组32例患儿中，Notch1基因阳性23例。其中B-ALL组26例，阳性17例(65%);T-ALL组6例，阳性6例(100%)，组间比较差异无统计学意义(P＞0．05)。T-ALL组与B-ALL组Notch1基因表达分别为1．42±0．58和0．71±0．27，组间比较差异有统计学意义(t=3．835，P=0．001)。

2Jagged1基因的表达情况

ALL、AML及对照组3组间Jagged1基因阳性率比较差异无统计学意义(P＞0．05)。ALL组及AML组Jagged1基因表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0．05)。ALL组与AML组比较差异无统计学意义(P＞0．05)。见表3，图2。ALL组32例患儿中，Jagged1基因阳性25例。其中B-ALL组26例，阳性21例(81%);T-ALL组6例，阳性4例(67%)，组间比较差异无统计学意义(P＞0．05)。T-ALL组与B-ALL组Jagged1基因表达分别为0．72±0．29和0．70±0．31，组间比较差异无统计学意义(t=0．127，P＞0．05)。

3Notch1和Jagged1基因在骨髓及外周血中的表达水平比较

在发病初期同时收集骨髓及外周血的9例患儿，进行骨髓和外周血中基因表达水平的半定量比较。Notch1基因在骨髓和外周血中的平均表达水平分别为0．79±0．24和0．77±0．23，差异无统计学意义(t=0．1460，P＞0．05)。Jagged1基因在骨髓和外周血中的平均表达水平分别为0．75±0．19和0．74±0．20，差异无统计学意义(t=0．1140，P＞0．05)。

4Notch1与ALL临床分型的关系

32例ALL患儿中，低危组Notch1阳性表达率为50%(5/10)，中危组为71%(10/14)，高危组为88%(7/8)。不同临床分型的3组间Notch1基因阳性表达率差异无统计学意义。

讨论

Notch基因最早发现于果蝇，该基因的部分功能缺失导致果蝇出现翅缘缺刻(Notch)。在脊椎动物中，共发现4个Notch同源体，Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。在哺乳动物中有5种Notch配体，Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4、Jagged1和Jagged2。Mummery-Widmer等［6］研究发现了参与非对称细胞分裂的6个新基因及调控Notch信号通道的23个新基因。Notch信号通路是进化过程中高度保守的信号转导通路，调控细胞增殖、分化与凋亡的功能，几乎涉及所有的组织和器官。在血液系统中，Notch受体及其配体在造血细胞增殖、分化过程中具有极为重要的作用。Notch还可促使造血干细胞向T细胞方向分化，并促进外周T细胞和脾边缘区B细胞的分化与成熟［7］。Notch信号在人类各种肿瘤中广泛表达。在肿瘤发生的过程中，Notch受体可能扮演致癌基因与抑癌基因的双重角色，这与组织类型、肿瘤发展阶段及Notch信号强度有关。

Notch信号通路与恶性肿瘤的关系最早在人类T-ALL中被发现［2］。在T-ALL中，普遍存在Notch信号的活化和Notch基因的高表达。Notch1～4的失调均与T淋巴细胞恶性疾患有关。Chiaramonte等［8］通过对34例白血病患者的外周血和25个白血病/淋巴瘤细胞系的研究发现，T细胞恶性肿瘤几乎都有Notch信号通路的活化。本研究发现，Notch1在儿童不同类型AL中的异常表达有明显差异，T-ALL发病与异常的Notch1信号通路有关。与正常对照相比，在ALL及AML患儿中，Notch1阳性表达率增高，并且差异具有统计学意义，而ALL和AML比较，差异无统计学意义，提示Notch1信号可能在AML中也起着重要作用。王冠玲等［9］应用免疫组化的方法研究了11例AML患儿，发现Notch1蛋白阳性表达率较高，考虑Notch1信号可能在粒系来源的髓性白血病中也起着重要作用。

Notch信号与B淋巴细胞恶性疾患密切相关。Jundt等［10］在霍奇金病的恶性B细胞中检测到Notch1受体高表达，与配体结合后，Notch1信号通路激活，促进转化B细胞生长，抑制亚砷酸导致的细胞凋亡。Wickremasinghe等［11］最近发现，Notch高表达可以抑制p53介导的细胞凋亡，导致慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞凋亡的发生，而阻断Notch信号后，p53表达水平升高并启动凋亡程序促使肿瘤消退。本研究对表达阳性的患儿进行半定量分析，Notch1在T-ALL中明显高表达，而在B-ALL中表达水平较低，二者差异有统计学意义。6例T-ALLNotch1基因全部表达阳性，而26例B-ALL中17例表达阳性，但差异无统计学意义，考虑可能与T-ALL病例数偏少有关。

AML源自造血祖细胞的失调，其特征为过度的自我更新和分化受阻。Tohda等［12］报道AML细胞系及病人AML细胞均有Notch1表达，因此研究推测Notch信号可能与AML细胞的异常生长有关，但进一步的研究却不支持该假设。Tohda等［13］检测了人类重组Notch配体Jag-ged1及Delta1对原发AML细胞生长和分化的影响，结果显示对短期生长的影响有3种:促进、抑制和无显著影响，而自我更新能力受到抑制或无显著影响。本研究对47例AL儿童中ALL组、AML组、对照组Jagged1阳性表达进行比较，发现各组间差异无统计学意义。Chiaramonte等［14］研究发现Jag-ged1在B-ALL、T-ALL、AML表达水平依次增高。周亚南等［15］报道，Jagged1表达趋势与Chiaramonte的研究一致但均低于正常供体。本研究验证了两者的共同点，但本研究结果显示，ALL、AML患儿Jag-ged1基因表达水平均比对照组高，而B-ALL组与T-ALL组比较差异无统计学意义。原发AML尽管Notch1信号活化水平较低，却有着Jagged1的高水平表达，Jagged1可能本身十分重要，不一定要与Notch信号通路激活有关，在髓系白血病发病过程中可能存在Jagged1信号自主活动。2009年，Tohda等［16］进一步研究发现，在AML细胞系中，配体活化的Notch信号对不同的细胞存在不同的调控反应，即活化的Notch通路促进了TMD7细胞增殖，抑制了U937细胞的分化及凋亡，在OCI/AML-6和THP1细胞，Notch信号抑制了细胞生长和自我更新，诱导细胞向类巨噬细胞分化。

本研究对9例在发病初期同时采集外周血与骨髓标本的初发AL儿童进行Notch1及Jagged1mRNA半定量检测，发现外周血单个核细胞中Notch1及Jagged1基因表达水平与骨髓液中单个核细胞中Notch1及Jagged1基因表达水平一致，差异无统计学意义。提示可用外周血替代骨髓液进行Notch1及Jagged1基因检测，而且可以减少AL儿童因骨髓穿刺造成的身体及心理伤害。不同类型ALL中的表达有明显差异，T-ALL患儿中的Notch1表达明显高于B-ALL患儿;在儿童AL细胞中，普遍存在Notch1信号的活化;Notch1在儿童AML中异常表达，提示Notch1在儿童AML中也起着重要作用。Jagged1在ALL及AML患儿中异常表达，还需要收集更多资料论证。