浅谈糖尿病的并发症研究性论文
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【摘要】目的观察δ-连环素在大鼠糖尿病模型海马神经元中的表达特征。方法根据实验需要将大鼠随机分成糖尿病组、正常对照组和缓冲剂组。按45mg/kg一次性尾静脉注射链脲佐菌素(溶于0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液)诱发糖尿病,缓冲剂组只给予等量的缓冲液。应用免疫组织化学方法观察海马神经元的形态结构变化，并应用计算机图像分析技术检测δ-连环素在各组中的定量表达。结果糖尿病组大鼠海马神经元中δ-连环素表达明显低于正常对照组和缓冲剂组，在海马齿状回减少尤为明显。结论糖尿病可下调大鼠海马神经元中δ-连环素的表达。
【关键词】δ-连环素;糖尿病;海马;大鼠;免疫组织化学
糖尿病神经病变是糖尿病常见的慢性并发症之一，可引起认知功能障碍及大脑的神经生理和结构改变[1-2]。海马是与脑高级功能相关的重要结构，在糖尿病患者中易受到损害，表现为更易发生中风、痴呆和认知减退[3]。
δ-连环素属于P120-catenin蛋白家族，特异性地表达在神经元[4]。研究发现δ-连环素过表达能诱导细胞形成树突状突起，并增加原代海马细胞中树突的形成[5]。已有报道δ-连环素基因变异小鼠表现出严重的学习障碍、突触可塑性降低和突触成分的改变。糖尿病患者认知功能减退的机制至今不明，在糖尿病动物海马神经元中δ-连环素的表达变化也鲜有报道。
1材料和方法
1.1动物分组及模型制备SD雄性大鼠，体重260～300g，徐州医学院实验动物中心提供。随机分成正常对照组、缓冲剂组和糖尿病组(n=9)。按文献[6]方法，一次性尾静脉注射链脲佐菌素45mg/kg(溶于0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液),缓冲剂组只给予等量的缓冲液。3天后测血糖，血糖>16.7mmol/L,饮水及尿量明显增多为造模成功。造模成功后常规饲养60天，中间不进行胰岛素干预，也不进行糖尿病饮食控制，造模后每周监测血糖。每组取9只大鼠5%茂巴比妥钠腹腔注射麻醉，经心脏先灌注100ml的生理盐水后灌注4%多聚甲醛〔0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，pH7.3配制〕固定30min。动物静置于4℃冰箱3h后取大脑，用上述固定液后固定约6h(4℃)。并修取含海马脑段，经20%蔗糖-PBS液沉底后，-20℃恒冷切片机切片，片厚20μm。每个动物均依次等距离间隔选取切片,贴片。
1.2血糖测定造模3天和取材前内眦静脉取血测血糖,血糖测定采用葡萄糖氧化酶法血糖试剂盒。
1.3SABC法免疫细胞化学反应切片经：①300mg/LH2O220min;②4%牛血清白蛋白(4%BSA)封闭，37℃30min;③δ-连环素1∶200，4℃18h后，室温孵育6h;④生物素标记IgG1∶300，室温孵育2h;⑤SABC复合物1∶300，室温孵育1h;⑥3mg/LH2O2和5mg/LDAB显色，显微镜下观察，出现阳性颗粒后终止反应。反应步骤③～⑥过程中，每步后均用0.01mol/LPBS，pH7.3漂洗3次，每次10min。切片经乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。
1.4海马齿状回DG区δ-连环素阳性反应产物吸光度测定分析每只动物各取进行过SABC反应的不相邻切片6张(间隔20μm)。400倍的高倍镜下，在海马DG区随机选取10个视野，采用Image-ProPlus5.1图像分析系统对各组δ-连环素反应阳性的细胞进行吸光度的半定量分析。实验数据用t检验进行统计处理。
1.5统计学方法所有结果用SPSS12.0分析。各组之间差异用单因素方差分析检验。再用Student-Newman-Keuls进行两两比较，结果用±s表示。P<0.05表示在统计学上有显著性差异。
2结果
2.1大鼠海马区δ-连环素的表达结果显示δ-连环素免疫反应阳性产物呈棕黄色细颗粒状，在海马各亚区的神经元胞质和胞膜中均有表达。显微镜下观察到，正常对照组(图1B，E)和缓冲剂组(图1C、F)大鼠海马神经元中的δ-连环素免疫反应的阳性颗粒色深密集，均明显高于糖尿病组(图1A、1D)。在海马齿状回(DG区)δ-连环素主要表达于颗粒层和颗粒下层，少量表达于门区。大鼠海马齿状回δ-连环素的表达在糖尿病组减少更加明显。正常对照组和缓冲剂组间大鼠海马神经元中δ-连环素的免疫反应差异不明显。
图1δ-连环素catenin在各组大鼠海马神经元中表达
其中A(×40)和D(×400)为糖尿病组，B(×40)和E(×400)为正常对照组，C(×40)和F(×400)为缓冲剂组
2.2海马齿状回(DG)δ-连环素阳性反应产物吸光度测定分析正常组和缓冲剂组海马神经元中δ-连环素吸光度(absorbance)(A)无明显差异，但分别高于糖尿病组304%和291%，其差别具有显著性意义。见表1。表1各组大鼠海马齿状回神经元中δ-连环素表达的定量分析结果3讨论
本实验发现δ-连环素在糖尿病组海马神经元中的表达低于正常对照组和缓冲剂组，提示大鼠糖尿病的神经性损害对海马神经元δ-连环素的表达产生了下调作用。超级秘书网
文献报道在糖尿病小鼠大脑中海马神经元的发生不足，数量降低。DG区海马神经元的发生可能与一定的记忆相关[7]。我们在实验中发现糖尿病组大鼠海马各亚区神经元变大肿胀，空泡样变，胞膜破损，及δ-连环素在DG区表达明显减少，表明δ-连环素表达的减少在糖尿病大鼠认知和学习记忆功能减退方面可能发挥一定作用。
δ-连环素参与钙黏连蛋白-连环素复合体的构成，在突触后膜与包括PSD95在内的PSD蛋白组分相互作用，并且在C末端包含1个PZD结合序列[8]。信号复合体(signalosome)是近年发现的激素对细胞进行调节的一种组合模式。已有文献报道，雌激素与PSD95对神经元突起和突触的结构调控，正是通过信号复合体的模式进行的[9]，在这一过程中，雌激素与PSD95形成signalosome。当雌激素与PSD95形成signalosome后能够对神经元突起和树突棘生长产生调控作用。推测由糖尿病胰岛素降低而产生上述实验结果的原因可能也是通过这种方式。另外在突触后膜δ-连环素也可能通过PZD结构域在不同的亚细胞区域与其他的蛋白相互作用[8，10]，而胰岛素的降低可能促进了δ-连环素与其他的蛋白的相互作用，从而改变突触塑型，进而引起认知功能和学习记忆功能减退。关于δ-连环素在糖尿病神经损伤过程中的分子生物学机制还需要进一步深入的研究。
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