微纳气泡制备及应用于医学的发展

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1微气泡的结构

1.1包膜材料

微气泡在自然条件下或被注入机体后,会发生破裂、溶解和自由联合,从而使造影失效。早期的微气泡造影剂无膜包被,不稳定,尺寸大(>10μm),不能经外周静脉注射,而是通过心导管插入主动脉或心腔内,属于有创性治疗。由于造影剂在血液中持续时间短、不能通过肺循环,导致左心不能显影,只能右心显影,因此其使用受到一定的限制。为了延长微气泡的造影时间,即提高其稳定性,后来人们开始研究特定材料包裹下的微气泡,发现其稳定性大大加强。如使用交联血清白蛋白封装的微气泡具有相当高的稳定性,可以在一定条件下较长时间保存。因此,考虑到微气泡作为造影剂的对比增强效果和其稳定性两方面,越来越多的包膜材料被研究。目前,主要的包膜材料可分为表面活性剂类、蛋白质类、脂类物质、聚合物和糖类物质。

目前已制备出的超声造影剂中大都或多或少含有一些表面活性剂成分,大部分基于表面活性剂微气泡的制备方法多采用超声空化、冷冻干燥、热气流干燥等。蛋白质类物质以人血清蛋白用于超声造影剂的研究及临床应用最多,此外,在蛋白质中加入一些助剂,可以显著提高蛋白质微气泡的性能,如在蛋白质中加入蔗糖形成的微气泡分散性较好,而且在加热的情况下也不破裂[3]。脂类物质尤其是脂质体作为微气泡超声造影剂包膜材料的研究越来越广泛,脂质体的粒径一般在几十个纳米到几个微米之间。脂质体通过化学修饰可以制成具有靶向功能的微气泡造影剂,在特定的器官部位聚集,实现对该部分的最佳造影效果,同时也可以进行靶向药物治疗等。

聚合物作为微气泡超声造影剂的包膜材料是由于分子间的作用力较强,从而提高膜的稳定性。聚合物膜可以做得非常薄,而且膜的弹性好,形成的微气泡非常稳定,能够避免巨噬细胞的吞噬,从而实现淋巴等部位的被动靶向造影[4]。基于糖类物质的微气泡超声造影剂一般均具有很好的安全性和生物相容性。

1.2填充气体

由于气体分子的扩散性,虽然包膜材料提高了微气泡的稳定性,但是仍不能很好地阻止气体分子向外扩张而使微气泡破裂。如交联血清白蛋白包裹空气的微气泡,其包膜厚度约为15nm,不能完全阻止气体的扩散,虽然有膜材包裹的微气泡比第一代微气泡造影剂稳定性大大增强,可在血液中维持5min[5],但是由于空气分子量较小,弥散度较高,扩张力较大而容易使微气泡破裂从而失去造影效果,人们趋向于研究造影效果持续时间更长的造影剂。因此,微气泡内部填充气体的研究随即展开,如Optison公司研制的血清白蛋白作为包膜材料、八氟丙烷作为填充气体的新一代微气泡造影剂,可以在血液中维持15min。目前临床所用超声造影剂均为内含填充气体的微气泡,其气体可分为二氧化碳、氧气或大分子惰性气体,大分子惰性气体多为氟烷气体,氟烷气体分子量较大,溶解度和弥散度较低,因此,内含氟烷气体的微气泡具有直径小、分布均匀、半衰期长等优点。

1.3治疗性组件

如之前所提到的,微气泡在药物运输及靶向治疗领域同样有着诱人的发展前景。一些治疗性的化学药物或者基因可以通过各种物理或化学的方式被微气泡携带,用低频超声波对微气泡进行示踪,用高频超声波使微气泡破裂从而定向释放携带的药物到目标组织,如肿瘤组织。通过这种定位治疗的方法,可以大大减少化疗的毒副作用。对于高密度聚合物封装的微气泡,可以把药物直接装载到微气泡包膜层中,当微气泡破裂时药物随之被释放出来,对于表面活性剂封装的微气泡,则通常将药物溶解在位于填充气体和包膜之间的附加疏水层膜中。除此之外,还可以将化学药物或者基因直接黏附在微气泡表面或者通过共价键连接在微气泡表面。

2微气泡的制备方法

传统的微气泡制备方法包括超声空化法和高剪切乳化法,但是随着医学技术的发展,用于临床超声造影剂的微气泡其稳定性、粒径大小等性质趋向于更高的要求,因此又出现了诸如喷墨印迹、微流体装置、纳米粒子交联等制备方法[6]。

2.1超声空化法

超声空化法是最常用的微气泡制备方法,是使用高频超声波使气体或者液体分散成为悬浮微粒并包裹于特定包膜材料内。首先,气体或者液体乳化形成微气泡或者微液泡悬浮在具有自动吸附性的涂层材料如蛋白质或者表面活性剂上,然后施以高温高压从而产生空穴现象继而对表层进行化学修饰以提高其稳定性。该法操作简单,成本低廉,但制备的微气泡粒径通常较大,微气泡在静脉注射前还要进行离心和过滤等操作以除去粒径过大的微气泡,否则在进入机体后很可能发生栓塞现象。

2.2高剪切乳化法

高剪切乳化法是另一种较常用的微气泡制备方法,尤其适用制备聚合物作为包膜材料的微气泡。该方法是在水性悬浮液中用高剪切的方法来对聚合物进行乳化,该过程需要使用一种既不溶于聚合物又不溶于水的液体来作为稳定剂。当聚合物溶液的溶剂充分挥发后,聚合物便开始出现脱水现象,从而使聚合物沉积在液滴表面形成有包膜的微球体。最后将微球体表面残余的溶剂通过洗涤除去,通过冷冻干燥的方法产生有气体填充的微气泡。用高剪切乳化法制备的微气泡的粒径大小取决于最初的乳液滴和后续加工过程中任何碎裂或者交联在一起的粒子的粒径大小,因此,制备的微气泡在投入临床应用之前也要经过必要的过滤处理。

2.3膜乳化法

膜乳化法,不同于超声空化和剪切搅拌,是迫使微气泡成分通过多孔膜而形成乳剂,有时需要不断重复这一过程。该法可在形成液滴后用上面提到的高剪切乳化法中的步骤获得微气泡,或者用气体作为分散相直接形成微气泡。这种方法的优点是对微气泡粒径大小有较高的可控性,和超声空化法及高剪切乳化法相比,膜乳化法制备的微气泡有更小的粒径,且不影响生产时间和容积率等方面的收益。该法制备的微气泡能更好地用于临床诊断及治疗。此外,虽然该方法很大程度上取决于膜的特性,例如膜上孔径大小、膜的硬度和湿度及膜表面处理等,但是却有可能制备出良好单分散性的微气泡。

2.4微流体装置

微气泡还可以通过微流体装置进行制备,且具有高度的粒径可控性和多分散性。在有限的压力和流速条件下,微流体装置仅提供操作控制,该方法已经很好地应用于单分散液滴的制备,近年来也逐渐应用于微气泡悬浮液的制备。目前用于微气泡制备的主要有两种类型的微流体装置:用软微影技术获得的重点流动单位和由封装在聚合物模块中的毛细管机械装配组成的T型接口。两种情况下的微流体装置共同的基本特征是具有一个可以使气体对流体进行撞击的孔口,从而产生喷射,然后在距孔口一定距离的地方气液接触面因不稳定而形成气泡。气泡直径大小的变化可以通过改变孔口大小而实现。

2.5喷墨印迹法

喷墨印迹法是一种用来改进微气泡均匀性的制备方法。气泡在一个直径20~50μm的不锈钢喷嘴处形成,由一个嵌有压电晶体的膛体为喷嘴提供流体,通过电压的改变在流体中产生脉冲,每产生1次脉冲就会有1个微小的液滴从喷嘴处被挤压出来,然后更多的液体被卷入膛体中,小液滴可以在空气中进行收集或者将喷嘴置于装有液体的容器中。和膜乳化法及微流体装置相比,喷墨印迹法的优点在于微球体的粒径可以通过压力脉冲的改变而改变,而不用去改变喷嘴的口径大小,同时也不需要高压来产生液体的流动,每个喷嘴的微气泡制备率高于膜乳化法中每个膜孔的制备率。目前此方法仅用于制备包裹有例如紫杉醇和包含有挥发性溶剂的聚合物微球体的小液滴,再通过挥发作用获得微气泡。

2.6纳米粒子交联法

微气泡的制备过程中,除了对微气泡的粒径大小需要进行精确控制外,对微气泡的膜壳厚度和薄膜材料的机械性能,如有效的剪切模量和对黏度等的精心控制也是很有必要的,因为这些因素会影响到微气泡的声学效应和破裂阈值。上述的各种微气泡制备方法在这些方面的控制上并不尽人意,而纳米粒子交联法制备的聚合物包膜的微气泡能够提高上述的性能,将单分散的聚合物纳米粒子置于稳定的微气泡表面,然后这些纳米粒子会交联形成统一厚度的包膜,如此制备的微气泡只达到了厚度及膜材料性能的高控制性,但其粒径大小却不易控制,因此可以将这种方法同其他方法相结合,例如和微流体装置结合。

3纳米气泡的制备研究

常规微泡超声造影剂是一种微米级造影剂,微泡的平均直径为2~4μm,小于红细胞,可以自由通过肺循环,但不透过血管,是一种血池显像剂。随着分子成像技术的不断发展,近年来涌现了多种纳米级超声造影剂,包括纳米级脂质体造影剂、纳米级氟碳乳剂以及一些纳米级微泡造影剂[7]。

将一定量的脂质体和特定的添加剂混合溶解在如氯仿及三氯甲烷等有机溶剂中,通过降压蒸发的方法除去溶剂,剩下的脂质滞留下来直到均匀分布,然后将余下的混合物置于超声放射装置下进行超声空化,同时通过注射器注入待填充气体如六氟化物等。超声空化后除去上层的泡沫即可获得稳定的气泡悬浮物。值得注意的是,在进行制备之前将特定的药物溶解在脂质体的油相中即可获得具有载药功能的纳米泡。

此外,纳米气泡还可以通过对微气泡进行离心分离的方法制备[8]。首先将脂质及辅助成分按一定比例混合后,经一定工艺制成悬浮液,然后缓慢注入全氟丙烷气体,最后采用水平往复式机械振荡得到原始微泡。此过程中可以在注入全氟丙烷之前对悬浮液进行冷冻干燥以增强脂膜的严密性,随后用水合液重新水合即可。在制备得到的原始微泡的基础上,采用低速离心法对原始微泡进行分离后,悬浮液分为两层,上层粒径尺寸较大,而下层粒径尺寸一般在200~700nm之间,提取出来即获得纳米级气泡。实验证明,采用低速离心法获得的纳米气泡造影剂大小适中、分布均匀、显像效果强、能与抗体结合且稳定性较好。

研究表明,疾病状态中的血管内皮间隙仅能允许直径小于700nm的颗粒穿过。纳米级造影剂能穿越血管内皮进入组织间隙,使血管外靶组织显像成为可能,从而超越了常规造影剂仅能发生血池内显像的局限性,推动了超声分子显像与靶向治疗向血管外领域的扩展。同时,物质的尺寸减小到纳米级别,分子特性会发生很大改变,表现出许多特有的性质,如半衰期长、表面反应活性高及强烈的吸附能力等[9]。目前关于纳米气泡的研究还有包括其作为造影剂的稳定性等一系列问题,相信随着技术的发展及研究的深入,这些问题会一一得到解决。

4微纳气泡的超声医学图像增强与分子成像

4.1靶向微气泡超声分子成像

靶向超声分子成像技术是指将带有特定配体的靶向超声微气泡通过静脉注入体内,通过配体与受体结合的方式,使超声微气泡选择性聚集于靶组织或靶器官,并通过超声检查产生靶组织细胞水平、分子水平显影的一种新兴的成像技术。超声造影剂是超声分子成像的基础,靶向超声造影剂通过特异性作用于病变区域生物分子组成成分来突出显示病变部位,从而提高超声诊断的准确性与敏感性,已成为目前的研究热点。目前临床使用的超声造影剂大都用微气泡制成。微气泡之所以能用于超声分子成像是因为微气泡具有很大的压缩性。在声场中,微气泡体积的张缩产生与人体组织不同的非线性振动从而产生特有的血池和血管造影信号。实验表明,用磷脂单分子膜制成的微气泡比用白蛋白或多聚物制成的微气泡所产生的超声反馈信号更强、更灵敏[10]。

分子成像的目的在于阐明机体疾病的分子及细胞方面的情况。炎症、血管生成和血栓形成是许多疾病的核心病理过程,引起血管腔内的分子表型发生变化。因此,靶向超声造影将有助于诊断多种疾病,如动脉粥样硬化、移植排斥反应及肿瘤新生血管生成等。总之,超声造影剂和靶向微气泡已经为超声分子成像开辟了广泛的临床应用前景。可以说,超声微气泡造影剂将继续对医用超声产生前所未有的影响。

4.2纳米微气泡的研究及应用

随着分子生物学技术的发展,超声造影不再局限于仅仅获取组织的血流灌注信息,而是逐渐应用于特异性的超声分子成像。超声分子成像并不是对传统超声造影概念的简单替代,而是提供一种活体模拟的免疫组化或原位杂交技术,通过靶向作用于生物分子来突出显示病变组织的显微病理基础,从而反映真正的发病机制,大幅度提高影像诊断的准确性和灵敏性。肿瘤血管由两部分组成,一部分是宿主固有的血管,该部分血管通透性正常,其管壁的最大孔径不超过100nm;另一部分是肿瘤新生血管,其结构不完善,基底膜不完整,通透性明显升高,其管壁最大孔径300~900nm。因此纳米级气泡在肿瘤分子成像方面具有极大的应用价值。目前对纳米级气泡的应用研究正日益广泛,如利用纳米级气泡超声造影剂不能透过正常血管、仅能透过高通透性的肿瘤新生血管的特性可进行肿瘤新生血管的评价。

5微纳气泡生物医学应用发展的主要趋势

5.1微气泡超声造影剂的应用研究

医学超声成像通常是依靠超声波在人体内传播的过程中所产生的回声来建立影像,作为一种医学影像技术,能提供体内器官重要的功能和解剖信息,是广泛的非侵入性的检测手段。用微气泡作为超声造影剂的原理是气泡在超声场中的高度可压缩性和对超声波的强回声反射。

超声微气泡造影剂现已广泛应用于心脏、肝脏、胰腺、肾脏等器官的超声影像诊断中。超声微气泡造影剂应用在泌尿生殖系统中时,在膀胱内注入对比剂,扫描膀胱、肾脏和输尿管,如果有膀胱输尿管或输尿管肾盂返流就可以得到显示。超声对比剂注入子宫内,增强的超声信号,可以清晰地显示输卵管通畅与否的情况。国内外学者报道[11],超声对比剂比传统的X线静脉肾盂造影和输卵管造影有更高的敏感性和特异性,可避免X线检查产生的离子辐射。因此,应用微气泡超声造影剂的超声检查在一些情况下可代替X线检查方法。超声造影剂由于在干燥环境中能维持30min[12-13]或更长时间,在肝脏成像中具有重要的应用价值。由于有对比剂使谐波成像等一些特殊的成像方式成像更加清晰,一些局限性肝病变,特别是肝脏的转移瘤和肝细胞肝癌的发现率明显提高。此外,利用微气泡的流变性和高强超声下的破泡空化效应,可用于评估微血管的灌注,从而为鉴别原位肿瘤和转移肿瘤提供了实时有效的手段。

一般来说,目前用于超声造影剂的微泡大都为微米级别,这是因为回波信号是和气泡的尺寸成比例的,较小的尺寸会导致较弱的回波信号,同时也会减小散射截面。因此理论上来说,纳米级气泡作为超声造影剂的效果并没有微米级气泡的效果理想。但是,当用更高频的超声波检测纳米级气泡的回波强度时发现,在有机体内的超声成像显示,纳米级气泡提供了比一般造影剂更强的显影效果,这是由于纳米气泡被诸如大量的肝吞噬细胞等吞噬,因而大量累积的纳米气泡产生了强烈的回波反射。在这种情况下纳米级气泡的造影效果优于微米级气泡。

5.2药物运输和靶向治疗

随着生物医药技术的迅猛发展,人们发现超声微泡不仅是一种良好的超声成像增强剂,而且是一种重要的药物递送载体。近几年国内外针对载药或载基因超声微泡的研究取得了许多重要进展。作为药物载体,超声微泡和超声技术结合可以实现局部定位释药,达到保护药物、延缓药物释放、减少给药次数和剂量、定位准确、降低药物对其他组织器官的毒副作用等目的[14]。

5.2.1肿瘤治疗在分子水平上发展起来的药物释放方法目前是超声联合微泡技术介导肿瘤治疗的基础研究热点。微血管壁和细胞膜是治疗药物进入细胞需要克服的屏障,使二者的通透性增加是药物治疗的前提。超声空化效应是微气泡造影剂作用的最重要机制。在低声压下,微气泡产生对称性压缩和膨胀,其直径保持相对恒定而不发生破裂,此称稳态空化;在高声压下,微泡压缩膨胀呈不对称性,最终可发生破裂,此称瞬态空化[15]。诸多研究表明,适当的超声辐射可使微气泡发生空化效应,使血管内皮细胞间隙增宽,血管壁通透性增大,从而提高细胞膜的通透性,促进药物进入细胞,从而保证了靶点较高的药物浓度。超声波与微泡还可增加化疗药物的细胞毒性,发挥协同增效作用,空化作用也可损伤细胞,抑制细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡。当超声联合微泡产生空化效应很强时,还可损伤血管壁,激活内源性或外源性凝血,诱发大面积毛细血管栓塞,阻断癌变组织的营养供应,导致肿瘤细胞的消亡。

5.2.2血栓溶解在血栓治疗方面,超声是一种被广泛应用于临床的影像检测手段,对血栓性疾病的早期诊断与随访观察具有重要的意义,但由于新形成血栓的回声与血液回声基本相似,因此,超声对新出现的血栓的检出率受到限制。针对血栓研制一种具有靶向造影作用的超声造影剂,无疑会提高微小新血栓的检出率。国内有研究人员[16-17]在制备出一种纳米级超声气泡造影剂后,将其运用于兔颈总动脉血栓模型,发现显影效果理想,为纳米颈总动脉血栓靶向性显像研究提供了研究基础。

另有实验[18]表明,微泡可顺利通过肺循环并迅速聚集于血栓发生部位,增强栓子与周围组织的显像对比度,而且不引起实验动物血流动力学的改变。有研究人员[19]在显微镜下观察到微泡可特异性地结合到血凝块上,且不仅被血栓周边或表面摄取,而且被吸收到血栓团块的内部,从而提高了血栓超声靶向显影的敏感性和治疗效果。此外,治疗性超声、微泡、溶栓药物联合应用于溶栓的效果明显好于超声与药物联合应用或单独使用药物溶栓,不仅更有效,更快速,且能减少所需溶栓药剂用量,减轻或避免不良反应,因此溶栓治疗已成为超声微泡药物运载系统最有前景的应用方向。

5.2.3炎症治疗将抗细胞间黏附分子21(ICAM21)抗体共价连接于全氟丁烷微泡的脂质外壳上,此种微泡可选择性结合于表达黏附分子的活化内皮细胞,使炎症的靶向显影具有更高的针对性和选择性。利用对炎症部位有靶向作用的微泡,不仅能使炎症靶向显影,评价炎症的严重程度,且可利用微泡来携带抗炎的药物到达炎症部位,从而达到治疗目的。若能将抗感染药物整合至微泡中,利用微泡对炎症部位的靶向作用,当微泡在炎症部位聚集时,给予超声照射,通过超声对微泡的空化效应,使得药物在病变局部释放出来,不仅能提高药物在病变局部的浓度,使治疗效果显著增加,而且可减少全身用药的不良反应。

5.2.4动脉粥样硬化治疗动脉粥样硬化的早期标志之一是单核细胞对内皮细胞的活化和黏附,这是由白细胞黏附分子如细胞间黏附分子上调介导的。已证明携带靶向ICAM21的单克隆抗体的超声造影剂在体内外结合效率较好。有实验使用并行板流动室测定携带抗ICAM21的靶向微泡与通过白介素-1β人工活化的上皮细胞之间的黏附性,与对照组非靶向微泡相比,靶向微泡的黏附增加了40倍[20]。

5.3超声微气泡介导基因治疗

人类临床基因治疗开始于1990年,虽然经过了十多年的发展,但是基因治疗仍然受阻于缺乏可于体内应用的安全、有效的基因转染方法。病毒性载体虽然具有很高的转染效率,但是有关它的安全性以及免疫原性方面的疑虑很多,已经有应用病毒性载体进行基因治疗发生死亡及瘤形成的严重事件报道。

在超声和微气泡的共同作用下,毛细血管基底膜以及细胞膜的通透性明显提高,甚至会使细胞膜发生暂时性的、可逆的、相对无害的穿孔,从而可以促使一些大分子物质通过基底膜屏障,进入组织细胞内。利用超声波和微气泡的这一特性实施基因治疗,已成为一种新的基因治疗技术。超声微气泡介导基因治疗可以有多种途径和方法,其中最常用最简便的方法是将治疗基因与微气泡直接混合后注入体内。

虽然有关超声波的安全性问题一直被争论,但是几十年的临床实践,以及目前超声诊断的广泛应用已经证明它对人体是非常安全的。微气泡造影剂外壳多用生物性材料如蛋白质和磷脂等制造,气体多为难溶而易于挥发的惰性气体,可经肺排出,由超声波造影剂所致副作用发生率很低。超声微气泡介导基因治疗的安全性较以往的转导技术要好。超声微气泡介导基因治疗兼具安全、较高效率、靶向性、可控性等优点,是一种很有前途的临床基因治疗技术,应该进一步探讨这一技术对不同目的基因、不同疾病的应用价值,并针对各种应用进行参数优化。

5.4微气泡多模式、多功能造影剂的研究与应用目前尽管各种影像技术如共聚焦和双光子荧光显微与成像、核磁共振、正电子发射断层成像技术、超声成像技术等为研究人员和临床专家获取解剖学和生理信息提供了强大的诊断手段,但是各种影像技术本身由于在时空分辨率方面各有优缺点,因此没有任何一种成像方式可以完整而足够地获取所有的生物信息。如核磁共振分辨率高但是敏感度低;放射性核素成像敏感度高但是分辨率低;尤其是超声诊断模式,虽然微气泡造影剂的出现提高了疾病诊断的准确性,但是超声诊断自身的分辨率较低,因此有必要对多模式、多功能的微气泡造影剂进行研究。

对于微气泡超声造影剂来说,即使包裹有氮气、全氟化碳等气体,但是其功效较低,且造影时间较短,因此有研究人员[21-22]制备出了膜壳装载有Fe3O4磁性纳米颗粒的微气泡,一方面由于Fe3O4颗粒能在一定范围内增加微气泡的膜壳散射截面,从而显著增强超声的显影效果,另一方面Fe3O4磁性纳米颗粒还可以作为核磁共振的造影剂,因此上述微气泡可以作为核磁共振和超声技术的双模式造影剂。

此外,多功能微气泡造影剂的研究还包括碲化镉纳米颗粒以及金纳米颗粒修饰壳膜的微气泡造影剂[23-24]。将多环芳烃和碲化镉量子点逐层堆积在由表面活性剂混合物通过超声空化法制备的微气泡表面可获得新型的多功能微气泡造影剂。连接有量子点的微气泡造影剂不仅维持微气泡原有的作为造影剂的功能,还可以利用微气泡的靶向功能将量子点定向运送到细胞或组织,然后通过超声靶向破坏微气泡从而获得细胞或组织的荧光成像;利用金纳米颗粒有效的吸收特定波长的光辐射和随之而来的在周围介质产生热声波的性质,包裹金纳米颗粒的新型微气泡可以在低频声波下发生震荡,这一研究开启了微纳气泡造影剂在光学成像方面的新应用。

6结语

经过多年的研究,微纳气泡超声造影剂的研究逐渐形成一个完整的体系,同时越来越多的应用价值被发掘和应用,其在制备技术、诊断和治疗应用等方面都取得了一定的成就。目前,微纳气泡发展还面临许多困难和难题,如靶向微纳气泡壳膜材料的稳定性、超声微纳气泡应用于临床上的安全性及超声治疗参数、膜材种类的选择应用等。相信随着相关学科如分子生物学和影像学的发展,这些问题会一一解决,微纳气泡超声造影剂在重大疾病的治疗方面的应用会取得巨大的成就,成为21世纪的新兴研究热点。