重金属钼离子免疫学研究
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一、结果与分析
1.细胞融合备用小鼠的效价与敏感性结果免疫小鼠血清抗体效价均达到1∶104，说明获得较好的免疫效果，其中3号小鼠效价最高为1∶（5．12×104）。以Mo6＋在3．906～1 000μg／L时与过量EDTA鳌合后形成的鳌合物为抑制剂，5只小鼠的抗血清均产生了抑制。其中3号小鼠抑制效果最好，将其A450值转化为B／B0，以B／B0为y轴，以Lg［Mo6＋－EDTA］为x轴，再对Lg［Mo6＋－EDTA］进行回归分析，3号小鼠的线性回归方程为y＝－32．185x＋96．364，r为0．977 1，IC50为27．57μg／L。3号小鼠的抑制曲线见图1。
2.Mo6＋－EDTA mAb杂交瘤细胞株的建立杂交瘤细胞株的筛选：细胞融合10d后观察融合效果，4块细胞培养板384孔中有杂交瘤克隆形成的有375孔，融合率为97．6％；同时进行间接ELISA和阻断ELISA检测，阳性48孔，阳性率为14．7％；3次亚克隆后获得4株杂交瘤细胞，分别命名为1E3、2D7、2F10、4B3。杂交瘤核型鉴定：NS0染色体数目为62～68条，小鼠脾细胞染色体数目为40条，本试验获得的4株杂交瘤染色体数目分别为98．3条、99．32条、98．1条、102条，平均99．4条，高于两个亲本的染色体数目，说明4株杂交瘤确实是两亲本细胞融合后的杂交体。杂交瘤细胞的稳定性测定结果：4株杂交瘤冻存前细胞培养上清效价与冻存15d、30d、60d复苏培养后上清效价基本一致，说明4株杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性良好。
3.Mo6＋－EDTA－mAb的免疫学特性鉴定效价测定 筛选出4株杂交瘤细胞，其中4B3株抗体效价最高，细胞培养上清效价为1∶（3．6×102），腹水效价为1∶（5．12×105）。敏感性测定 敏感性结果见表1，4株杂交瘤细胞株抑制曲线。4株杂交瘤细胞株均获得较好的敏感性。4株杂交瘤细胞的Mo6＋－EDTA－mAb对Mo6＋－EDTA均具有较高的敏感性；其中4B3细胞株的敏感性最高。特异性鉴定 4B3杂交瘤细胞的mAb的交叉反应试验结果可知，4B3杂交瘤细胞的mAb对Mo6＋－EDTA的IC50为23．4μg／L，对Cr3＋－EDTA的IC50为28．59μg／L，具有较高交叉反应率；与其他金属离子螯合物交叉反应性较低可忽略不计。
二、讨论
1.Mo6＋－EDTA－pAb的免疫学特性鉴定抗体的免疫学特性主要体现于抗原抗体反应的结合容量、亲和性和选择性3个方面。结合容量大小以效价来衡量，本试验采用间接ELISA测定其效价，免疫动物后均获得较高的效价，效价最高达到1∶（5．12×104）。由于pAb为异源性抗体，其亲和性不均一，测得Ka值的准确性不高，所以本试验亲和性得检测用敏感度来衡量，敏感度是由抗原抗体反应的亲和性决定的，用IC50值计算灵敏度，代表标准品对抗原抗体结合50％是的抑制质量浓度，IC50值越小，灵敏度越高。本试验中2号鼠产生的pAb的IC50值为37．94μg／L，在免疫鼠中最低，亲和性最好。本研究采用交叉反应试验鉴定其特异性，结果表明免疫鼠产生的Mo6＋－EDTA pAb均具有较高的特异性。
2.杂交瘤细胞株的筛选方法制备高质量的mAb需要建立可靠的杂交瘤细胞筛选体系，一般有3条要求，一是准确测定上清效价，二是能够避免桥抗体的产生，三是确定mAb的特异性。本试验同时采用间接ELISA和阻断ELISA筛选阳性杂交瘤，以Mo6＋－ITCBE－OVA作为包被原采用间接ELISA法测定上清效价，Mo6＋－EDTA作为标准品采用阻断ELISA法确定阳性杂交瘤，可以简便地筛选出效价高、无桥抗体、特异性强的Mo6＋螯合物杂交瘤细胞株。本试验所制备Mo6＋－EDTA－mAb为高亲和力抗体。
3.关于交叉反应性mAb的交叉反应性表示mAb与竞争物结合的结构特异性，是揭示参与反应混合物与其交叉结合的重要化学参数。本试验所制备的Mo6＋－EDTA mAb除与Cr3＋－EDTA有较强的交叉反应性外，与其他金属螯合物和EDTA无交叉反应；Khosraviani M等建立的水样中Cd2＋间接竞争ELISA检测方法，也与Hg2＋具有较强的交叉反应；王建华等所建立的钼离子多克隆抗体ELISA竞争法，也表现出与汞离子有较强的交叉反应。Jones R B等采用距离矩阵法（distancematrix，DM）比较不同金属－螯合剂复合物分子三维结构的差异，发现Cd2＋－EDTA与Hg2＋－EDTA的三维结构差异最小，认为这可能是抗体对Hg2＋产生交叉反应的主要原因。Love R A等认为，螯合剂与金属离子通过化学键结合而使螯合剂的构型发生改变，螯合剂结合不同金属离子具有不同的构型，螯合剂的构型是决定抗原抗体识别的重要因素。本试验中Mo6＋－EDTA与Cr3＋－EDTA亲和性高，可能是钼铬在同一副族，离子半径相近，原子结构相似，化学性质接近的原因。
作者：范国英 王自良 姜金庆 黄华国 张海棠 丁菡 李艺
