脂肪干细胞免疫学性质探讨
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1资料与方法
1.1一般资料
搜集本院2014年3月~2015年3月健康志愿者6例,志愿者均与抽脂要求相符,作为研究组；另选同期6例健康志愿者作为对照组。纳入标准：均对本研究知情；均身体健康。研究组女3例,年龄21~37岁,平均年龄(28.46±3.36)岁；男3例,年龄20~38岁,平均年龄(29.65±3.34)岁。对照组女3例,年龄22~38岁,平均年龄(28.51±3.29)岁；男3例,年龄21~38岁,平均年龄(29.70±3.42)岁。两组健康志愿者性别、年龄一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2方法
分别抽取两组健康志愿者脂肪组织25g,将其放在离心管中,后转为培养皿中,准备处理,离心管与培养皿均为无菌；剔除组织中筋膜及血管,使用无菌溶液反复进行冲洗；处理后,用眼科剪对其进行分割,大小约为1.5mm3,直至分割成糊状,在37℃环境下,选择Ⅰ型胶原酶(0.1%)予以震荡进行消化处理,速度为120r/min；采用LG-DMEM培养液和胎牛血清(10%)终止消化,并离心10min,后获得高浓度的间质组织细胞团,对其进行处理,选择红细胞裂解液,并去除红细胞,采用筛网(100μm)进行过滤；将过滤液取出,使用链霉素100g/L、青霉素100U/ml、LG-DMEM培养液、胎牛血清进行重悬处理；处理后,将其置于培养皿中,直径为100mm,接种,设定浓度4×104/cm2；接种后,在体积分数5%CO2培养箱中进行培养,温度设定为37℃,且每隔2d更换一次培养液；待细胞生长检测80%~90%时,按照比例1∶2进行传代培养。观察目标细胞分化群表面抗原和组织相容性抗原表达的特点,方法选择流式细胞术。首先使用BSA-PBS溶液(0.5%)对脂肪干细胞标本进行洗涤,离心10min,1000r/min,获取单细胞悬液,转变细胞浓度1×109/L；其次对组织相容性抗原Ⅰ(MHCⅠ)、MHCⅡ、CD44、CD29、CD90、CD31、CD45、CD34进行荧光标记,将标记后物质加入悬液,将其和荧光标记的非特异性IgG同型进行对比分析,在37℃环境下进行培养,30min后,反复使用PBS进行处理,使用多聚甲醛予以固定,用量30g/L,最后实施检测,仪器选择流式细胞仪。
1.3观察指标
观察细胞分化群表面抗原和组织相容性抗原表达的特点,同时对异体脂肪干细胞及淋巴细胞共同培养的增殖情况进行观察。
1.4统计学方法
采用SPSS13.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(x-±s)表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1脂肪干细胞分化群表面抗原和组织相容性抗原表达的特点
采用流式细胞术检测脂肪干细胞分化群表面抗原和组织相容性抗原表达的特点,阴性表达抗原：CD31(2.81±1.04)%,CD34(17.12±0.54)%,CD45(1.39±0.27)%。阳性表达抗原：CD29(91.22±1.03)%,CD44(90.83±2.37)%,CD90(94.02±0.69)%。由此得知,脂肪干细胞无造血系统污染及内皮细胞污染问题。
2.2淋巴细胞共同培养情况
对照组与研究组CPM比较,差异无统计学意义(P>0.05),表示脂肪干细胞对异体移植的排斥作用较小。
3讨论
脂肪的组织基质内存在大量ADSCs,作为成体干细胞,具有多向分化潜质,在诱导条件适宜的情况下可分化成软骨细胞、成骨细胞及脂肪细胞等,且增殖能力较强。研究显示,ADSCs不仅具有细胞多分化功能,如软骨、肌肉、成骨、神经、脂肪等,而且其表面标志表达同BMSs(骨髓间充质干细胞)一致,包括CD166、CD106、CD105、CD29等。B7-1、HLA类抗原、B7-2、CD40L和CD40在BMSc不表达,体外BMSc能对淋巴细胞的反应进行抑制,而体内应用BMSc可使异体移植皮片成活时间延长,故同种异体BMSc是目前组织工程主要细胞来源。体外培养时ADSCs对淋巴细胞增殖的抑制及刺激能力为ADSCs体外的免疫学性质,试验包括单向淋巴细胞增殖反应、双向淋巴细胞增殖反应,前者主要用以检测刺激细胞ADSCs所致淋巴细胞的增殖程度,数值用增殖后的数量表达,且数值和ADSCs免疫原性之间呈正相关；后者主要用来检测双方抑制淋巴细胞增殖的作用,不对两种细胞进行灭活,互相作为反应细胞及刺激细胞,数值用增殖后两种细胞的总数量表达。ADSCs体外试验与多种可控因素相关,在体内试验中,ADSCs免疫学性质为复杂性免疫反应综合作用的结果,异基因抗原免疫反应与细胞因子、补体系统等密切相关。脂肪干细胞没有造血系统污染及内皮细胞污染问题,对异体移植的排斥作用较小,临床应加强对细胞分离及培养的深入研究。
作者：韦慧玲 单位：河南省郑州市第七人民医院检验科
