生物医学中NO探究

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1NO的生物化学

NO是一种难溶于水、高脂溶性的小分子气体,极易通过细胞膜扩散。它拥有额外电子,化学反应能力强,生物学半衰期为3～5s。体内NO是由NO合成酶(nitricoxidesynthase,NOS)催化L-精氨酸(L-Arg)转变为L-瓜氨酸时产生的。NO在多种细胞中均能生成,生成后很快被氧化成NO2-和NO3-,从而失去生物学活性。NOS是NO反应通路的限速酶,根据其来源及作用特点,可分为神经元型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)3种;根据其被提纯顺序及克隆结果,又可分为3种同工酶,即同工酶Ⅰ(nNOS)、同工酶Ⅱ(iNOS)、同工酶Ⅲ(eNOS)。nNOS与eNOS在体内可连续表达,通过Ca2+内流及钙调蛋白(CaM)激活,激活后产生短时效少量的NO;而iNOS则需要α-肿瘤坏死因子(TNF-α)、γ-干扰素(INF-γ)、白细胞介素1(IL-1)、细胞脂多糖(LPS)等诱导才表达,产生局部高浓度的NO而介导后继的长效反应[1]。一般认为,iNOS的激活不依赖于Ca2+/CaM,但目前3种NOS在Ca2+/CaM依赖性上的区别日趋模糊。

NOS的C端与细胞色素P-450还原酶有共同序列[2],具有显著同源性。3种同工酶是不同的基因产物,种属间NOS氨基酸序列具有高度保守性,人类各同工酶之间序列同源性为50%～60%,而不同种属动物间相同同工酶序列同源性大于90%。目前3种同工酶的cDNA结构已被克隆和表达。所表达的3类NOS的N端结构极其相似,可能与其L-Arg结合位点和催化活性有关。利用特异性DNA探针已经证明,人NOS3种同工酶基因分别位于12号、17号和7号染色体,它们的基因结构已部分搞清,对基因中某些结构区域的功能也有了一定了解。通过某些细胞因子、酶类、Ca2+/CaM及激素等调控因子对NOS基因表达影响的研究,阐明了mRNA稳定性是NOS活性的重要调节点[3],而且NO能反馈抑制NOS的活性。NO的作用靶是鸟苷酸环化酶(GC)。NO与含血红素的GC上Fe2+结合,激活后的GC导致cGMP水平增加,cGMP再作用于cGMP依赖的蛋白激酶及磷酸二酯酶,调节离子通道,使有关递质释放而发挥生理效应。NO激活的GC可使cGMP生成速度加快50～200倍。NO和GC的结合代表着一种新的广泛存在的将细胞外信息转导为邻近细胞内cGMP的信息传递机制。NO对腺苷二磷酸(ADP)核苷基转移酶也有作用。此酶可将ADP的核苷基团转移至线粒体蛋白与线粒体中酶蛋白的羧基上,使蛋白构象改变而发挥作用。影响NO生物作用的主要因素是NO的生物半衰期。另有报道,NO能降低细胞内的游离Ca2+浓度,从而防止细胞内Ca2+浓度过高,保护细胞;反过来,NO生成又依赖于细胞内游离Ca2+,Ca2+对维持NOS活性是必需的。

2NO对机体主要系统的作用

2.1NO对心脑血管系统的作用NO是血管平滑肌扩张剂,可使血管舒张,血压下降。正常情况下,血管内皮细胞和心内膜释放少量的NO,维持适度的血流、血压和脑血管屏障通透性。NO通过cGMP抑制血小板的凝集和粘附,发挥内源性抗血栓作用。NO是血管内环境稳定的重要分子,异常的NO生物利用度与许多血管疾病有关[4]。在病理情况下,NO释放减少,内皮素增加,可导致血管舒缩功能调节失调、血小板凝聚和内皮细胞增殖,引起一系列心血管疾病,如高血压、血管痉挛、高胆固醇血症和动脉粥样硬化性心脏病等。低浓度NO对充血性心衰、循环性休克、脑缺血、动脉粥样硬化和高血压等许多疾病有治疗作用。临床上应用的硝普钠(SNP)、硝酸甘油等NO供体药物,都具有舒血管作用,同时还有更重要的细胞保护效应。NO供体保护心肌的主要机制是降低过氧化物酶活性,减少超氧自由基,进而减少中性粒细胞粘附于内皮和保护内皮机能;另一方面,NO通过降低心肌对β-肾上腺素能刺激的反应性而使耗氧量减少[5]。NO供体对脑、内脏、肾等各种血管床缺血再灌及休克治疗中的内皮功能保护也有特殊作用。

2.2NO对神经系统的作用NO是一种特殊的扩散性神经递质,不贮存于突触小泡内,既可作为突触前递质从神经末梢释放;也可作为突触后递质,从突触后膜释放。在外周神经系统中,NO作为突触前递质从非肾上腺素能非胆碱能(NANC)神经元末梢释放。NO除直接作用外,还通过调节乙酰胆碱、儿茶酚胺、兴奋性和抑制性氨基酸、5-羟色胺、组织胺等神经递质间接发挥作用[6]。NO与学习记忆关系密切。海马中一些区域在重复刺激后可产生长时程突触增强(LTP)效应,NO对维持LTP有重要作用。用SNP可使海马突触效应持续增强,而向海马神经元注射NOS抑制剂NG-硝基-L-精氨酸(L-NNA)和用Hb结合NO都可阻断LTP。从NO入手将为寻找新型促智药及防治早老性痴呆病(AD)提供新思路。NO与痛觉传导密切相关。给与NOS抑制剂L-N-硝基精氨甲酯(L-NAME)后,小鼠在福尔马林足底注射法、热板法和乙酸导致的扭体模型上,均表现出明显且持久的抗伤害作用。但无炎症并发的急性和慢性疼痛似乎不依赖于NO[7]。

NO在嗅觉、视觉、触觉的感应传导中也发挥作用。NO是阴茎勃起的主要递质,能增强性功能。用NOS免疫组化技术,发现NOS选择性地分布于支配大鼠阴茎平滑肌的神经元中。直接应用NO和L-Arg会产生如神经受刺激一样的海绵体平滑肌松弛作用,而NOS抑制剂选择性地抑制肌松弛。NO在中枢神经系统及其对某些神经递质释放的调节中有双重作用。eNOS可舒张血管和增加脑血流而具有神经保护作用。nNOS活性增强可加剧神经元损伤。过量释放的NO可诱发癫痫,导致脑损伤和记忆缺损。例如,AD病人的大脑海马中NOS阳性神经元数明显低于正常人。而帕金森氏综合症(PD)患者脑胶质细胞中iNOS的表达与神经元损伤相关,其大量生成的NO加剧了多巴胺(DA)神经传导障碍。军用神经毒毒剂梭曼对小鼠的毒性可被Arg增强,被L-NAME减弱,且有剂量反应关系,而且梭曼中毒后小鼠大脑、小脑、海马中NOS活性增加[8]。

2.3NO对免疫系统的作用巨噬细胞、炎性中性粒细胞、组织中免疫细胞等被内毒素或T细胞激活,表达iN-OS的mRNA,生成的iNOS催化产生大量NO。内源性NO是巨噬细胞杀伤靶细胞的信使分子,它通过非特异性免疫机制对抗侵入机体的微生物和病原体。肺和肝是机体循环路径中的主要免疫滤过器,其非特异性免疫功能依赖于NO。NO还具有免疫抑制作用,在植物血凝素刺激的淋巴细胞体外增殖反应中,从巨噬细胞产生的NO可抑制淋巴细胞增殖反应。许多细胞因子,如IL-1、IL-2、TNF和IFN以及某些细菌内毒素可以单独或联合激活巨噬细胞产生NO,即正向调节。而另一些细胞因子如TGF-β、IL-4、IL-10、巨噬细胞灭活因子等可抑制巨噬细胞产生NO,即负向调节。巨噬细胞产生的NO对某些细胞因子的产生也具有调节作用。由此可见,作为免疫调节因子,NO的产生受细胞因子严密调节,处于复杂的细胞因子网络监视之中。

2.4NO对呼吸系统的作用NO可使气管、支气管平滑肌松弛。低浓度(5×10-6)吸入NO或雾化吸入释放NO的复合物是强有力的支气管扩张剂,可用于临床治疗支气管哮喘等疾病。20×10-6的NO可有效预防成人呼吸窘迫综合征(ARDS)[9],且在一定浓度范围内,浓度越高作用越明显。急性肺损伤时,由于LPS及多种细胞因子的作用,iNOS被激活,血浆及呼出气中NO浓度升高。多量的内源性NO有双重作用,一方面通过血管平滑肌扩张、心肌收缩力下降、多种代谢酶功能紊乱等而具有损害作用;另一方面通过降低肺动脉压、减少血小板粘附及白细胞出游等发挥有利作用。但吸入适量NO可选择性降低肺动脉高压,改善氧合作用,而对体循环无影响。在慢性支气管炎中,NO生成也增多。目前,测量上呼吸道NO已成为一项新的诊断指标。另外,吸入NO对早产儿和新生儿ARDS的救治也有效。最近发现,NO是呼吸道上皮细胞离子通道的调节器,它在呼吸道疾病及其防御中发挥重要作用[10]。

2.5NO对消化系统的作用NO是胃肠道NANC神经主要的抑制性神经递质之一,对食管收缩或舒张功能、食管括约肌功能及食管蠕动功能有调控作用。免疫组织化学发现,NOS分布在肠系膜神经丛、神经轴突和肠粘膜。NO对胃肠道粘膜具有重要保护作用,如局部胃粘膜应用NO溶液或硝酸甘油、SNP等,能减轻酒精引起的胃粘膜出血。临床上治疗胃溃疡的药物生胃酮,就是通过释放NO而发挥对胃粘膜的保护作用的。应激性胃粘膜损伤时,粘膜血流量明显下降,粘膜通透性增加,血浆及粘膜NO含量明显升高,用L-NAME可明显加重粘膜损伤,并阻抑应激所致的血浆及粘膜内NO含量升高,使粘膜血流量更趋下降,而L-Arg可逆转L-NAME的作用[11]。nNOS和eNOS诱导产生的NO,主要通过胃粘膜血流、上皮细胞分泌和屏障功能,保持胃肠粘膜完整性;而iNOS诱导产生的NO与胃肠道组织损伤有关[12]。NO对肝细胞功能、肝脏毒性和肝硬化的血液动力学也起重要调节作用。

3NO与寄生虫感染

NO在疟原虫感染中的作用比较复杂。NO一方面可杀伤疟原虫,对宿主起保护作用;另一方面过量生成的NO又对宿主产生毒副作用。肝细胞对疟原虫子孢子的杀伤作用是L-Arg依赖性的。在疟原虫裂体增殖期间,宿主免疫细胞可产生NO以杀伤裂殖子,L-Arg的拮抗剂能减弱这种杀伤作用。感染疟原虫的小鼠血浆内的NO2-水平明显高于正常小鼠[13]。由于疟原虫诱导宿主细胞的NOS活性明显升高,可引起脑微血管内皮细胞、巨噬细胞等产生大量NO,NO扩散到周围神经元,从而干扰正常的神经传导。用灭活的曼氏血吸虫尾蚴接种于小鼠,其皮肤内iN-OS表达水平明显升高。用NO合成抑制剂氨基胍处理小鼠,其对血吸虫尾蚴感染的抵抗力明显降低[14]。山羊感染肝片吸虫第3周,血浆中的NO和TNF-α开始升高,它们作为炎性介质可能参与了肝片吸虫对肝的损害过程。因为NO和TNF-α对寄生虫也有抑杀作用,所以二者还与宿主抗肝片吸虫的机制有关[15]。NO对细胞内克氏锥虫有杀伤作用。应用NOS抑制剂NG-单甲基-L-精氨酸(L-NMMA)后,NO生成减少,杀伤锥虫作用减弱,锥虫血症发生率及动物死亡率均增加[16]。鸡感染球虫后,血浆NO2-水平明显升高,但并不随球虫感染剂量的增加而增加,与虫株毒力大小也无直接关系[17]。中国农业大学从1997年开始进行NO与球虫感染关系研究,结果表明,雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫或堆型艾美耳球虫后,血浆NO2-水平均明显升高。eNOS抑制剂L-NAME、L-NA和iNOS抑制剂L-AG均能降低感染球虫雏鸡血浆NO2-水平和NOS活性。

4NO与肿瘤

NO在肿瘤的发生、发展和转移等过程中均起作用,但对于不同的肿瘤类型,随时间、部位及局部浓度的不同,NO的作用也很复杂。肺腺癌组织中,总NOS活性比正常肺高。人卵巢肿瘤中有iNOS表达,且其活性与肿瘤的分化程度相关,高分化卵巢癌iNOS活性比中分化和低分化者高。慢性肝炎继发肝癌(HCC)病人,血清中NO水平明显高于非HCC者,也明显高于肝硬化并发HCC者。而在乳腺癌中,NO的水平则低于正常。肿瘤中少量NO的产生可增加肿瘤血流量并促进血管新生,如转染了NOS基因的人结肠癌细胞系,较其来源组织生长快且血管分化程度也高[18]。NO还可促进前列腺素PGE2的合成。PGE2有促进血管生成作用,同时可增强血管通透性,有利于肿瘤组织摄取营养。但NO在肿瘤起始及演进过程中的作用机制仍不甚清楚。NO具有杀瘤和抑制肿瘤转移的效应。原发性肺癌病人的肺泡巨噬细胞由于iNOS活性增加,NO生成显著高于对照组[19]。卡介苗(BCG)可用于膀胱癌的治疗,但NOS抑制剂可拮抗BCG的疗效。通过将iNOS转染到转移性黑色素瘤细胞,发现能极大地减少转移,表明肿瘤细胞产生的NO可降低其转移潜能。宿主细胞产生的NO也能通过阻止循环中的瘤细胞对血管内皮的粘附而抑制转移,小胶质细胞分泌的NO可抑制肿瘤的脑部转移。因此,通过转染iNOS可能成为杀伤肿瘤细胞和控制肿瘤转移的有效途径[20]。NO参与肿瘤细胞的凋亡过程。50%以上肿瘤可检测到p53基因突变,NO引起DNA损伤也促使p53蛋白积聚而使细胞生长抑制乃至引发凋亡[21]。随着NO在肿瘤生物学研究的深入,将对肿瘤发病及其治疗提供有益的启示。

5NO的毒理学

内源性NO以pmol/L或fmol/L浓度存在时,可激活G蛋白,参与信息传递。以nmol/L浓度存在时,则诱发细胞毒性和损伤DNA,导致基因突变和癌变。同时,NO还能抑制某些与细胞呼吸和DNA复制有关的关键酶活性,使细胞能量代谢和DNA复制转录发生障碍,从而影响细胞的生长、发育和分化。另外,NO的一系列氧化还原形式,一方面作为还原物质清除引起脂质过氧化发生的物质,另一方面也介导、引发脂质过氧化发生。吸入NO时,产生的过亚硝酸盐对肺泡表面活性物质的功能有不良影响。TK6人成淋巴细胞接触NO(5.5～22mmol/L)后,其DNA单链断裂,并随着剂量的升高和时间的延长而增加[22]。活化巨噬细胞产生的NO也诱发靶细胞中DNA链断裂,这种损伤可被L-NMMA抑制。NO通过氧化使胺亚硝基化,进而使DNA、RNA、腺嘌呤和鸟嘌呤发生脱氨基作用,产生的脱氨产物随NO浓度增加而增加。NO对培养的哺乳动物细胞有诱变作用。在TK6细胞培养时,直接通以5.5～22mmol/LNO1h,经6d表达,NO诱发TK基因位点和HPRT基因位点突变,并与浓度有依赖关系。SD大鼠吸入一定浓度的NO,将其肺细胞原代培养,结果也表现出诱变性。NO供体药物SNP能诱发g12细胞gpt位点突变和双微核形成,并与NO2-含量升高呈正相关。提示SNP释放的NO过量积累可能是导致g12细胞遗传毒性的主要原因。NO是沙门氏菌TA1535的强诱变剂。在NO浓度为12.3mg/m3时,回复突变数为本底的10倍,回变体随剂量增加和接触时间延长而增加,TA1535基因突变谱多是C→T转换。NO供体药物能诱导TA1535回复突变,其中精氨-NO复合物诱发的回变率可高达本底的100倍[23]。NO表现出的致突变性与DNA碱基脱氨和错误修复以及自由基致DNA氧化损伤有密切关系。

6结语

NO具有广泛的化学反应性和作用位点,介导和调节许多器官系统的生理、病理生理功能。它是一把双刃剑,即有作为生物信使和免疫调节的有利的一面,也有潜在的毒性。目前国内有关NO及NOS的研究报道正逐年增多,但在兽医界自1997年后才由中国农业大学在NO与寄生虫感染方面开始研究,更多的研究仍在机理方面。虽然有NO混合气体直接吸入、NO供体药物和NOS抑制剂治疗诸多疾病的报道,但距实际临床应用仍有一定距离,其有效性和安全性仍需进一步评估。综上所述,应考虑在以下几个方面开展研究工作。(1)探讨在某一条件或处置前后,动物、器官、组织或细胞NO含量和NOS活性的改变,及NO供体药物和NOS抑制剂对生理和病理生理的影响,以揭示机理,拓展思路,为疾病防治提供依据。(2)开展NOS的分子生物学研究。包括NOS组织定位、提取纯化及分型、基因序列分析、检测NOSmRNA、克隆NOS基因,通过载体使基因转入细胞,用于某些治疗目的等。(3)开展NO供体和NOS抑制剂的药理毒理学研究,开展已有药物的NO/NOS机制研究,为药物作用机理和新药研发提供依据和方法。