胶原应用及发展
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1胶原的结构
资料表明[5],皮胶原的形成可以简略地表示为:氨基酸→多肽→原胶原分子→胶原微纤维→胶原纤维。很明显,皮胶原的单体是原胶原分子。原胶原分子呈细棒状,长20nm,直径1.5nm,相对分子量接近300×103。每一个原胶原分子均有3条肽键,每条肽链上有1052个氨基酸。在N端尾肽和C端尾肽之间的1011个氨基酸残基的排列很有规则,反复出现甘XY三肽(X、Y分别代表其它氨基酸)而形成结构稳定的螺旋区。螺旋区内的甘XY三肽共有337个,其中1/3是甘脯X三肽。此外,在螺旋区内还有1/4是酸性和碱性氨基酸残基。由于在α肽链上出现了甘脯X三肽而形成了胶原所特有的、结构紧密的左手螺旋。3条具有左手螺旋结构的α肽链,通过互相折叠盘绕形成右手复合螺旋。皮胶原的结构稳定性一方面依赖于静电作用、氢键、范德华力、氨基酸的亲水性和疏水性、配位键及二硫键等来维持。另一方面皮胶原分子内和分子间所存在的醛醇缩合交联、醛胺缩合交联和醛醇组氨酸交联等对提高皮胶原结构的稳定性发挥着重要作用。
2皮胶原的主要性质
2.1胶原的理化性质
胶原是一种蛋白质,是由氨基酸组成,因此其理化性质必然与氨基酸的理化性质相同或相关,例如两性电离及等电点、紫外吸收性质及呈色反应等。同时胶原又是生物大分子化合物,还具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点。此外,酸、碱、盐和蛋白酶等都可以与胶原发生化学作用,胶原在酸或碱的长时间作用下,其交联键会遭到破坏而发生胶解。不过,多数蛋白酶对胶原的作用机理至今尚不清楚,其作用过程也难以控制。中性盐与胶原的作用依其种类不同而各不相同,有的中性盐可使胶原脱水,有的则会引起胶原膨胀(即充水)。胶原的耐湿热稳定性是衡量胶原结构稳定性的一项重要的物理指标。迄今为止,在制革生产和科学研究中,人们普遍采用测定皮胶原的收缩温度(shrinkagetemperature)的方法来判定胶原的湿热稳定性。
2.2胶原的物理———机械性能
若干具有三股超螺旋结构的Ⅰ型胶原分子通过侧向共价交联、错位阶梯式排列聚集成直径为50~200nm的胶原微纤维。胶原微纤维再进一步侧向排列形成胶原纤维。正是由于胶原纤维具有如此复杂且特殊的分子结构,才使得胶原纤维具有优良的力学性能[6]。显然,胶原的物理机械性能主要取决于它的化学组成及交联程度。此外,胶原的螺旋结构对胶原的物理机械性能也有着举足轻重的影响。应力-应变实验结果表明,作为天然高分子化合物的胶原表现出弹性态和粘弹态两个阶段的力学行为。而变性胶原(没有螺旋结构)仅表现为少许弹性态性质,其断裂拉力仅为天然胶原的一半[7]。
2.3皮胶原的生物医用性能
(1)皮胶原具有作为生物医用材料最适宜的微孔径,而且其分布量大,这些特点赋予材料以较好渗透性,适于营养物质、生物因子扩散及血管长入。(2)创面止血和缓解疼痛的功能。有文献报道[7],胶原可以促进血小板凝聚和血浆结块,从而达到创面止血的目的。有人认为[8],胶原使血小板凝聚能力似乎来自游离的氨基酸侧链氨基。封闭胶原侧链羧基,虽然不会造成凝聚能力的明显下降,但是却会减弱胶原促使血浆结块的作用。总之,胶原所具有的超分子结构,是其凝聚能力的基础。关于胶原的缓解疼痛功能,虽有临床现象证明,但目前尚未得到合理的解释。(3)诱导并促进细胞生长。胶原的粘附性良好,对成纤维细胞有一定的生物诱导性,有利于细胞的长入及基质沉积、新生血管生成和伤口愈合。临床已有报道,在胶原蛋白凝胶中培养肝细胞诱导聚集体的形成,从而使每个细胞合成白蛋白的量比非聚集体增加2倍[8]。(4)可生物降解性[9]。胶原在生物酶作用下可以部分或全部水解。利用胶原的可生物降解性,人们设想当胶原类材料植入人体后,新生组织或器官即可将其作为支架开始生长,长成后,胶原类材料自行降解为小分子被人体吸收,从而达到彻底治疗的目的。然而胶原类材料的降解情况受局部因素的影响较大。胶原类材料的降解速度的可控性不如合成材料。因此,在这方面必须进行大量的研究。胶原的可生物降解性具有二重性。胶原类材料植入人体后,如果降解速度过快,则新生组织或器官尚未长成,达不到预期目的;如果降解速度过慢,则会影响新生组织或器官的生长。理想的情况是寻求最佳的降解速度。
3胶原在医学领域中的应用
胶原的结构与性能表明它是一类优良的可用于引导组织再生的生物材料,已经广泛地应用于医学领域中。
3.1天然真皮替代物
主要有2种类型:一种是除去表皮层的异体真皮;一种是无细胞真皮。无细胞真皮可以是异体皮,也可以是人皮。关于无细胞异体真皮及无细胞真皮的应用,国内外均有报道,可用于治疗深度烧伤创面。而无细胞人体真皮的来源十分有限,特别是存在传播恶性疾病的危险(尤其是艾滋病)。由于上述原因,在很大程度上,天然真皮替代物的应用受到限制。
3.2人工皮肤
众所周知,组织工程材料的第一个面市的商品是人工皮肤,也是到目前为止在临床应用方面最为成功的材料之一,这方面的报道很多[10~13]。已经报道的人工皮肤的制造方法有很多种。Yannas等人首先用胶原硫酸软骨素多孔交联支架成功地制得人工皮肤,据临床报道,这种人工皮肤已被美国FDA批准,其商品名称为Dermagraft,主要用于严重烧伤和糖尿病患者皮肤溃疡的治疗,对慢性皮肤溃疡也具有很好疗效。但是已有的人工皮肤都存在结痂及易引发各种炎症甚至导致癌变,而且应用范围极为有限。1998年5月,美国FDA又批准了马萨诸塞州坎顿器官发生有限公司的一种名为Apligraf的人工皮肤生产。据报道,这种人工皮肤是一种人工两层皮肤,表皮在上,真皮在下。具体制造方法可能是从牛腱中提取胶原,经纯化后,制成胶原膜,再经过杀菌、消毒即可使用。有的则对胶原膜进行交联,经杀菌、消毒后备用。也可以将胶原膜作为基质材料在其上种植上皮细胞经培养而制成人工皮肤。这一类人工皮肤均有助于因腿部血液循环不畅引起的静脉溃疡患者的伤口愈合。此外,国内外还报道了胶原GAG/PGL网成纤维细胞真皮替代物、胶原壳聚糖人工真皮及胶原粘多糖复合组织工程支架材料等等。由此可见,过去国内外基于皮胶原的组织工程材料主要是明胶、胶原凝胶及其与天然生物材料、高分子化合物的混合物。迄今为止,已有的人工皮肤或医用胶原膜的应用范围极为有限,所有的人工皮肤都不能全面地满足医疗手术的要求。究其原因,主要是存在以下不足:(1)作为皮肤的替代物,由于不能重建毛囊、汗腺、脂腺等皮肤附件,从而在相当程度上降低了患者对环境的适应能力;(2)血管化较慢;(3)抗感染能力差;(4)力学性能差,在含水条件下难以塑形,不利于人体内部器官的重建;(5)体外及新生组织细胞产生的胶原酶极易将其降解。材料在体内降解吸收过快,使得材料不能与体内的组织细胞生长、增殖的速度相匹配等等。针对上述问题,研究者们主要采取了三个方面的措施:第一,通过对人工皮肤或医用胶原膜的改性来提高其力学性能;改性的方法主要是物理方法交联(如热交联、UV和γ射线交联等)、化学方法交联(如使用甲醛、戊二醛进行交联)、接枝改性(如使用RGD肽)及低温等离子改性等等;第二,多种材料复合,提高其综合性能;第三,使用生长因子。研究人员通过利用促进血管形成的生长因子包裹支持组织的多聚物载体而成功地促进了在实验室里生长的生物人工组织的血管发生。
3.3可注射性胶原
主要用于整形美容,是纠正皮肤凹陷型缺陷的最理想材料,其主要适应证为皱纹、寻常痤疮疤痕、小型外伤疤痕等缺陷的填充矫正。此外,对糖尿病患者在其病变部位注射胶原有助于足部溃疡和褥疮的修复。应用较为广泛的胶原植入物是可注射性胶原溶液,主要用于矫治由于年老、创伤、疾病和先天性畸形所引起的外形异常等。
3.4可降解胶原缝线
由于胶原植入物在人体内会降解为氨基酸而被人体吸收,因而利用胶原制成的胶原缝线用于特殊的医疗手术具有重要意义。临床应用表明,可吸收的胶原缝线用于眼科的角膜手术中,很少有不良反应。此外,还有关于在动物实验中利用经过纯化的胶原膜(厚度0.0013mm)作角膜移植并用液状胶原替代晶状体的报道。
3.5止血海绵
研究表明,胶原不仅能够诱导血小板附着,产生释放反应,而且能够激活血液的凝固因子,粘接在渗血的伤口上,对已经损伤的血管起填塞作用,从而达到止血的目的。临床应用表明,与藻酸钙、藻酸海绵、凝血增强纤维泡沫、增凝明胶海绵及氧化纤维素等常用的止血剂相比,胶原的止血率高,副作用小,因而是一种理想的止血材料。利用胶原研制胶原止血海绵,国外一直十分活跃,国内目前尚处于起步阶段,但发展还是很迅速的。据报道,国外已经有粉状及片剂的微晶胶原止血剂[14]、纤维织物止血剂和海绵止血剂等。一种取自牛跟腱的无过敏性、无菌异种冻干胶原已广泛应用于临床,并取得良好效果。国内也有类似产品问世[15]。
3.6组织引导材料
据报道,目前国内已有医用组织引导再生胶原膜产品面市。临床应用表明:此种医用胶原膜具有特有的网状结构,可参与组织愈合过程并能引导、促进细胞生长;具有显著引导/诱导组织再生的作用,使创面实现功能性、再生性的愈合;物理机械性能优异,手术操作简便,生物相容性好,无抗原性,不引起三致反应,可降解、吸收,不需二次手术取出;可广泛应用于软、硬组织损伤的修复,如口腔科、骨科、整形外科、五官科、神经外科及肌腱断裂和脏器穿孔等的治疗。与此材料匹配的是膜引导组织再生技术(GTR技术)。GTR通过引导膜机械地阻碍非目的细胞(如表皮细胞)进入组织修复区,可使目的细胞(如骨细胞)在修复区浓集,以达到组织定向修复的目的。GTR技术最早应用于四肢长骨,20世纪80年代初,逐渐应用于口腔科。GTR引导膜主要有2种:一种是非生物降解膜,如聚四氯乙烯膜;一种是可生物降解膜,主要有胶原膜和冻干硬脑膜等。由于非生物降解膜较坚硬,易造成软组织裂隙、膜暴露、细菌感染等,且需要实施二次手术除去,故在临床中已倾向于采用可生物降解的GTR引导膜。
3.7用于骨组织工程中的“Ⅰ型胶原X”植入材料
Ⅰ型胶原是骨骼中的主要结构蛋白,约占有机基质的90%。胶原在骨组织工程中可以有3种作用:①作为支架材料,可为骨细胞的长入提供支架,促进新骨生成;②利用胶原的止血性能;③具有覆盖陶瓷或金属植入物的功能。目前,国内外一般利用胶原与羟基磷灰石结合制成复合材料,植入人体,以修复骨缺损。例如,瑞典开发出一种Colipat植入物,它就是由从猪皮中提取的胶原与纯度为90%的羟基磷灰石以5∶1的比例混合制成。据报道,该材料已用于临床实验,结果证明无炎症反应,且具有良好的生物相容性。由Zimmer等公司开发出的作为植骨替代物的生物材料被称为Collagraft,其中含有从牛真皮胶原中提取的纯化胶原纤维丝和羟基磷灰石/三磷酸钙陶瓷,可将Collagraft与自体骨髓相混合,自体骨髓能提供成骨前体细胞。临床应用表明,大多数患者对胶原未发生免疫反应。即使有些患者产生牛胶原抗体,对植入物的疗效和安全性也均无影响。
4展望
大量的研究结果表明,胶原的性能可以满足用于作为表皮细胞、成纤维细胞、角膜细胞、软骨细胞及骨细胞的培养基质。但是,利用胶原制做组织工程支架材料,尚存在以下亟待解决的问题:(1)力学性能差,在含水条件下难以塑形,故不宜用于内部器官的重建;(2)体内及新生组织细胞产生的胶原酶极易将其降解;在体内降解吸收过快,不能与组织细胞生长繁殖的速度相匹配;(3)为提高胶原的力学性质和降低其在体内的降解吸收速度,使用戊二醛对胶原进行交联,形成网状交联大分子,但戊二醛用量较难控制,过量时引起胶原制品发黄,产生毒性,不利于组织细胞培养生长,量少时达不到改进胶原性能缺陷目的。笔者认为解决上述问题的基本途径主要有:
(1)采用脱细胞技术制造天然的胞外基质(ECM)作为组织工程支架材料,其优点在于这种天然的ECM在体内可以组织填充物而长期存在,有较好的组织相容性和亲和性,还可以诱导和调节细胞的生长、繁殖和分化等。
(2)采取物理、化学交联方法,克服胶原材料(主要是凝胶、膜等)所存在的降解吸收快、机械强度小的缺点。主要改性方法有①物理方法,如热交联、UV和γ射线交联等;采用物理方法交联的优点是不会引入有毒化学物质,但不易获得很好的交联强度,交联的均匀程度也不理想;②化学方法,通常采用戊二醛、甲醛进行交联。采用化学方法交联,可以获得均匀一致的交联,但交联过程可能会引入有毒的交联剂和产生不良的副反应。据报道,用酰基叠氮或聚环氧化物交联,既不会引入明显的毒性,又可获得理想的交联效果。此外,对胶原材料的低温等离子改性和用RGD肽(精氨酸甘氨酸天冬氨酸)接枝改性,可进一步改善胶原材料的生物学性能,提高其促进细胞粘附和增殖功能。
(3)制备胶原基复合材料,为改善胶原材料的性能,利用胶原与其他合成材料、天然生物材料复合来制备胶原基复合材料已经成为一个重要的发展方向。目前主要有①胶原透明质酸(HA)的复合物系统,它可以作为可注射骨替代材料;②胶原壳聚糖;③胶原poly[HEMA]与乙醇混合,用过硫酸铵和偏亚硫酸钠引发交联反应,制成烧伤用的贴膜,在膜中加入药物吲哚美辛。实验表明:胶原poly[HEMA]Ⅲ型胶原的复合物所具有的多孔海绵状结构是良好的药物释放系统,是制备烧伤用创面敷料的良好材料。
总之,解决上述问题后,胶原在医学领域中的应用前景将会更加广阔。
