纳米材料的医学运用

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1生物荧光标记

荧光分析法由于其较高的检测灵敏度而成为生命科学研究领域重要的研究方法之一，其检测灵敏度在很大程度上依赖于荧光标记物的荧光强度和光学稳定性。目前使用的传统有机荧光材料由于吸收波长范围较窄，使用时仅能在较窄的波长范围内选择特定波长的光对其进行激发，而且其发射光谱较宽，不同荧光材料的发射光谱有可能互相重叠，从而降低了同时使用不同荧光材料对不同分子进行荧光标记和分析的可能性。此外，传统有机荧光材料的发射光谱一般不具有对称性，信噪比和稳定性相对较低，在光照几分钟后即发生褪色现象。这些缺陷极大限制了其在生命科学领域更为深入广泛的应用。量子点一般是指尺寸小于激子玻尔半径的Ⅱ-VIA或Ⅲ-VA元素化合物所形成的纳米晶体。当可见光的光子照射到量子点上时，量子点的某些电子会被激发至较高能级，当这些电子从较高能级回到其基态时，量子点就会以荧光的形式发出特征频率的光子［3］。

与传统的有机荧光材料相比，量子点具有较大的吸收范围，因而能够在较宽的波长范围内被激发从而发出荧光，利用这一性质，可以在单一的激发波长下使用多种量子点进行荧光标记［4，5］。而且，量子点的发射光谱较窄且具有对称性，因而不同量子点的发射光谱之间基本不存在相互重叠()。此外，可以通过对量子点的粒径、组成和表面性质进行修饰从而对量子点的发射波长进行调控，使得量子点可以在从紫外到红外波长范围内的特定频率下发射荧光，利用这一特点，可以通过合成方法设计制备出大量发射波长不同的量子点［6，7］。此外，与有机荧光材料相比，量子点具有较高的稳定性，可以在数小时内经历多次激发和荧光发射的循环过程，而且其荧光具有较高的亮度和褪色阈值。量子点的上述几个特性使得其非常适合于进行复合荧光标记，进行标记时可以根据不同量子点所具有的不同颜色和强度的荧光对不同的靶向分子进行标记。在利用量子点进行生物荧光标记的研究初期，由于一些技术性原因，尤其是量子点表面包覆问题，在标记时存在荧光强度、选择性和分辨率较低等问题。作为量子点生物荧光标记的早期研究者之一，Bruchez等［6］将CdSe-CdS量子点表面包覆细胞生物素，并首次成功利用其对小鼠3T3成纤细胞进行荧光标记，但标记后的荧光信号强度较低，且绝大部分量子点非特异性地分布在核膜上。

与此同时，Nie等［7］利用转铁蛋白对CdSe-ZnS量子点进行包覆，并经过受体介导的细胞内吞作用进入HeLa细胞对其进行体外荧光标记，以识别IgG免疫抗原，并利用IgG修饰的CdSe-ZnS量子点对免疫抗体进行荧光标记，但其特异性仍然较低，且未进行体内标记测试。尽管利用量子点进行生物荧光标记的初期研究存在上述问题，但仍然引起了研究人员极大的兴趣，在材料学及生物科学领域引发了广泛的研究热潮。随着材料表面科学和生物医学的深入研究，利用量子点进行生物荧光标记在荧光强度、特异性及灵敏度等方面得到了极大的发展。Wu等［8］利用免疫抗原IgG和链酶亲和素对CdSe-ZnS量子点进行修饰，然后利用其对人体乳腺癌细胞SK-BR-3进行体外及体内荧光标记，以检测细胞表面的肿瘤标记物Her2(人类表皮生长因子受体2)。测试结果表明，与传统的有机荧光标记方法相比，该方法具有极高的特异性，且显示出优异的荧光强度和荧光稳定性。更为重要的是，该研究显示利用两种发射波长不同的量子点即免疫抗原IgG修饰的量子点和链酶亲和素修饰的量子点，可以在同一激发波长下同时对小鼠3T3成纤细胞2种不同的细胞内蛋白质分子肌动蛋白和微管蛋白进行荧光标记，表明与传统的有机荧光材料相比，量子点可以更为有效的同时对多种细胞内分子进行荧光标记。2004年，Nie等［9］使用两亲三嵌段共聚物对TOPO包覆的CdSe-ZnS量子点进行修饰，并在其外表面连接各种肿瘤特异性配体，利用其对裸鼠体内的人体前列腺肿瘤细胞进行标记。

结果表明，通过量子点表面连接的肿瘤特异性抗体，量子点可以有效定位于肿瘤细胞并与细胞表面的肿瘤特异性生物标记物相结合，通过波长分辨成像技术，成功对成活裸鼠体内的肿瘤细胞进行高灵敏度多色荧光标记()。随着研究的不断深入和拓展，量子点在体外生物荧光标记方面的应用目前已进入较为成熟的阶段。Xie等［10］利用生物素与链酶亲和素之间的特异性相互作用，将小鼠肝癌细胞MEAR中的DNA适配体(TLS9a)生物素化，将其连接于链酶亲和素修饰的量子点上，制备出生物荧光探针。利用该探针对不同肿瘤细胞及正常细胞进行荧光标记。结果表明，该探针能够特异性识别MEAR小鼠肝癌细胞，且该探针具有良好的生物相容性，在对MEAR细胞识别后未对细胞生长和细胞存活产生毒副作用()。Dong等［11］将水溶性CdTe量子点与大鼠抗小鼠CD4抗体相连接，并利用其对大鼠脾脏进行荧光检测。结果表明，该荧光探针可以有效对大鼠脾脏进行直接荧光标记，而且与常用的有机荧光材料异硫氰酸荧光素(FITC)相比，该荧光探针显示出优异的荧光检测强度及良好的荧光稳定性。

2靶向药物输送

在药物研发和药物治疗领域，药物输送是一个必须考虑的重要因素。药物的靶向输送对于多种疾病如癌症和神经性疾病的治疗至关重要。因而，目前对药物的靶向输送研究已成为药物研发和药物治疗的核心问题之一。对于一个药物输送体系而言，其尺度大小对于有效将相关药物输送至细胞内部至为关键。由于血管自身孔径的限制，仅允许直径小于50nm的药物自由进出，而对于细胞，仅有直径小于100nm的药物可穿透细胞膜进入其内部发挥疗效。目前，仅有人工合成的纳米输送系统能够较好的满足这一要求。此外，药物的溶解性是影响药物疗效的重要因素之一，而目前近半数的化学合成药物在水中是不溶的或溶解性较差，严重影响了药物充分发挥其疗效，因而已成为目前药物药物治疗领域的一个主要问题。

纳米颗粒由于其特有的性质，使其在药物输送方面具有广阔的应用前景。由于其较小的尺寸，使得纳米颗粒能够较为有效地进入细胞内部。纳米颗粒较大的比表面积使其能够有效结合、吸附及输送其它化合物如小分子药物、多肽、蛋白质及核酸分子，而且其较大的比表面积赋予纳米颗粒所负载的药物分子良好的药物动力学特性及其在靶向组织器官中优异的生物分散性，进而可以有效的提高药物疗效［12，13］。纳米颗粒具有优先聚集于靶向位点的特性，这一特性使其所负载的药物在健康的组织器官部位的浓度较低，从而可以最大程度地降低纳米颗粒及药物本身的毒副作用［14］。而且，纳米颗粒可以有效提高疏水药物在含水介质中的溶解性，使疏水药物能够适合于进行非肠道给药治疗。纳米颗粒还可以有效提高多种药物如疏水药物分子、多肽及寡聚核苷酸的稳定性［15，16］。此外，生物可降解的纳米输送体系可以大幅度提高药物的生物相容性，并可在最大程度上降低药物本身的超敏反应，如呼吸困难、皮疹、胸痛、心跳过速、水肿及外周神经炎症［17，18］。Bahadur等［19］首先利用氨基硅烷对Fe3O4纳米颗粒进行包覆以实现其氨基官能化，然后通过Michael加成反应将丙烯酸甲酯和精氨酸接枝于纳米颗粒表面，形成平均粒径在10nm左右的树枝状磁性纳米颗粒药物载体。细胞生物学测试结果表明，该树枝状磁性纳米颗粒本身对Hela细胞无细胞毒性，显示出良好的生物相容性。

通过静电相互作用将抗癌药物链霉菌成功结合于该磁性纳米颗粒表面，测试结果表明，在最佳酸度条件下，药物分子可以有效得以释放，且在外加磁场作用下，其药物释放效率可以得到极大提高()。Wheate等［20］利用含氨基的磺基化聚乙二醇对直径为30nm左右的金纳米颗粒进行修饰，以提高其水溶性及有效载药量，然后将抗癌药物草酸铂连接于该纳米颗粒表面。电子探针显微分析结果显示，与超支化聚合物及树枝状聚合物相比，其有效载药量可大幅度提高。细胞生物学测试表明，与纯的草酸铂相比，该官能化金纳米颗粒可将肿瘤细胞内的药物浓度提高1倍。此外，在负载草酸铂之前，官能化的金纳米颗粒对肿瘤细胞未显示明显的抑制作用。而在负载草酸铂之后，与纯的草酸铂相比，其对肿瘤细胞的抑制率可有效提高5～6倍。Hanessian等［21］利用端基分化叠氮二羧酸将抗肿瘤药物喜树碱共价连接于聚乙烯胺分子上，然后将其负载于超顺磁氧化铁纳米颗粒上。将该生物连接体作用于人体黑素瘤细胞并进行相关测试，荧光发射光谱及透射电子显微镜测试结果表明，该生物连接体可有效进入肿瘤细胞内并定位于脂类囊泡中。细胞生物学测试结果表明，在外加磁场作用下，通过该生物连接体的酯水解作用，其所负载的喜树碱可自脂类囊泡中有效释放并进入细胞核中，从而明显提高了药物疗效()。

3生物分子检测

在生物医学领域，DNA和蛋白质的检测对于疾病的诊断、遗传性疾病的治疗以及传染性病原体的检测极为重要。目前，对于DNA分子的分析一般先通过聚合酶链式反应(PCR)对其进行扩增，然后利用有机荧光染色剂对其标记从而加以检测，该方法对于DNA的检测下限为pmol。然而，该分析方法存在本质上的缺陷，比如，有机荧光染色剂过宽的吸收峰和发射峰及其荧光猝灭的不均匀性均会明显降低该方法的检测灵敏度，而且PCR过程中的选择性及非线性扩增现象会导致DNA表达的失真。对于蛋白质，目前均通过免疫染色的方法对其进行分析检测，酶联免疫吸附检测(ELISA)依然是蛋白质的标准检测手段，该方法的检测下限同样为pmol。对于多种疾病而言，在发病初期或缓解期，其相应的生物标志物如特异性蛋白质分子仅以fmol的极低浓度存在于患者体内，ELISA对于如此低浓度的蛋白质分子的检测无能为力。当这些特异性蛋白质分子浓度提高至ELISA的临界检测浓度时，一般疾病已发展至晚期。因而，寻找具有更高灵敏度的生物分子检测手段对于疾病的早期诊断至关重要。纳米颗粒由于其较小的尺寸、较高的反应活性、优异的物理性质以及这些性质的可调控性，使其在制备用于蛋白质、核酸分子检测的生物亲和性传感器方面受到广泛关注，可以利用其建立新的检测方法以改善目前的检测方法所存在的缺陷，因而具有良好的应用前景。

Jia等［22］将人癌胚抗原(CEA)的检测抗体和单链DNA(ssDNA)连接于直径为13nm左右的金纳米颗粒表面，再将辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素连接于ssDNA上，制成酶标记金纳米探针。然后，通过碳二亚胺活化的共价偶合作用，将抗CEA捕捉抗体连接于羧基官能化的磁性微粒上，以制备磁性探针。在利用酶标记金纳米探针和磁性探针对相应抗原进行免疫检测时，磁性探针首先通过其连接的捕捉抗体与抗原相结合，而该抗原又同时与酶标记金纳米探针上的检测抗体相结合，然后在外加磁场作用下对其进行分离，最终利用酶标仪对其进行检测。结果显示，该检测方法可以显著提高对CEA抗原的检测灵敏度，比常规ELISA的检测灵敏度提高130倍左右，而对于非特异性蛋白如p53则仅显示出较弱的响应()。Rusling等［23］以谷胱甘肽为修饰剂，制备出粒径为5nm左右的可溶性金纳米颗粒，并通过层层组装的方式将聚(二甲基二烯丙基氯化铵)(PDDA)和谷胱甘肽-金纳米颗粒组装于热解石墨上以形成纳米金电极，利用EDC［1-(3-(二甲氨基)-丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐］—NHSS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)偶联技术使连接于PSA(前列腺特异性抗原)上的一抗与电极上金纳米颗粒层中的谷胱甘肽羧酸根通过共价键的方式相结合，从而将PSA固定于纳米金电极上以组成检测电极。

利用该检测电极对PSA进行检测时，首先将抗PSA抗体(二抗)和HRP连接于磁球上，制成二抗-磁球-HRP生物复合物，并将检测电极浸入该生物复合物中，然后将H2O2注入检测体系中，测定HRP中的Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)氧化-还原电流。由于H2O2可将HRP转变为可直接被电极还原的亚铁氧(ferryloxy)态，因而造成循环伏安检测结果中的氧化峰消失，而还原峰有所增大。通过对体系的电流检测并对数据进行进一步处理，即可以得出体系中PSA的浓度。与常规的ELISA方法相比，该方法可以将PSA的检测灵敏度提高2000倍左右，并成功检测出前列腺肿瘤患者血浆样品中的PSA()。

4细胞及生物分子的分离纯化

细胞及生物分子如蛋白质等的分离技术是细胞生物学、免疫学、干细胞研究及临床医学研究中的一种重要研究工具。细胞的分离、纯化及表征已经成为生命科学及临床医学领域中必不可少的手段之一。例如，自体骨髓移植就要求对肿瘤细胞进行高效去除，在肿瘤的早期临床诊断中要求对患者血液中的少量肿瘤细胞进行分离富集;另外，分离T淋巴细胞并对其功能性进行诊断在确定人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、艾滋病和自身免疫性疾病的发展进程中至关重要［24，25］。基于细胞分离技术在上述领域的重要性，目前对于细胞分离技术的研究着重于发展出可明显提高稀有细胞(如干细胞、抗原特异性B细胞和T细胞及稀有性外周血循环肿瘤细胞)的分离纯度和分离效率的有效方法。由于大多数靶细胞的存在浓度极低，使得目前对于这些细胞的高纯度分离仍然较为困难［26］。目前常用的细胞分离方法可以分为两大类，第一类是基于细胞的物理性质如尺寸、形貌和密度差异，通过过滤和离心的方法对细胞加以分离;第二类则是利用细胞表面的生化特性和生物物理性质对细胞加以分离，如固体亲和基质分离法和荧光活化细胞分拣法。一种理想的细胞分离方法应该是能在不影响细胞功能的前提下于短时间内分离出大量高纯度靶细胞。

目前的这些分离方法仍然存在较多不足之处，过滤和离心的方法对细胞存活率有较为显示的副作用，选择性较差且不易大规模进行;荧光活化细胞分拣法尽管具有较高的选择性，但其效率较低，且具有较高的技术要求。因而，寻找出一种产量、纯度和收率均较高的细胞分离方法迫在眉睫。近年来新出现的磁性分离方法已经成为生物学和临床医学上一种重要的对细胞和蛋白质进行选择性分离的技术，它可以对细胞进行大批量分离，且获得的靶细胞纯度较高［27，28］。Gu等［28］将氨基三乙酸连接于粒径为8～10nm的磁性纳米颗粒表面，由于纳米颗粒的高比表面积、快速的移动性及良好的分散性，使得其与组氨酸标记的蛋白质分子之间具有较高的结合效率，而且磁性纳米颗粒的使用使得在对蛋白质分子进行分离时无需对细胞裂解液进行预处理。在外加磁场的作用下，对组氨酸标记的蛋白质进行分离，并利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDA-PAGE)对其产物纯度进行检测，结果表明，分离产物中仅含有组氨酸标记的蛋白质，其分离特异性显著优于商业化磁性微球。该功能化磁性纳米颗粒对靶蛋白分子的结合力为商业化磁性微球的200倍，且利用缓冲溶液对该功能化磁性纳米颗粒进行重生后，其对靶蛋白的亲和能力、选择性和分离效率可以完全恢复并进行重复利用。Earhart等［29］通过将生物样品特异性抗体连接于磁性纳米颗粒表面以实现其功能化，然后在外加磁场的作用下将待分离样品通过含有功能化磁性纳米颗粒的分离筛，分离筛狭缝周围的磁性纳米颗粒被外加磁场磁化，从而产生较高的局部磁场梯度，并在狭缝处产生边缘磁场。由于局部磁场梯度的作用，磁性纳米颗粒及其所捕获的靶细胞被富集于狭缝处，其它成分则可自由通过分离筛。去除外加磁场并利用合适的缓冲溶液冲洗分离筛，即可对靶细胞进行释放富集。利用该方法对靶细胞的捕获效率可以达到37%，而且捕获到的靶细胞可以实现完全富集()。

5磁共振成像(MRI)增强

MRI技术作为一种临床诊断技术，广泛应用于临床医学及基础研究中以提供高质量的人体解剖图像。在临床诊断中，基于解剖学差异，作为一种无损技术的MRI可利用强磁场和射频范围内的非电离辐射对正常组织和病变组织(如肿瘤)加以区分［30］。MRI信号依赖于径向和横向质子的弛豫时间，正是二者之间的差异造成了不同组织在MRI图像中的对比度有所不同。机体组织中水分的内在弛豫时间与其生理环境有关，因而其在病变组织中会有所改变，尽管这种变化的特异性较小，但在病变晚期，该特异性会明显增强。因此，MRI非常适合于对病变进行特异性诊断。利用MRI造影剂可以对组织的弛豫时间加以调控，从而提高图像的信号强度和对比度。目前MRI技术的应用越来越依赖于造影剂，MRI技术和造影剂的联合使用可以极大地提高对血管系统［31］、炎症组织［32］、肿瘤血管形成［33，34］、动脉粥样硬化斑块［35，36］以及血脑屏障损伤［37］的成像效率。在新出现的细胞和分子磁共振成像技术中，造影剂已成为该技术中的关键因素。该技术力图在分子和细胞水平上将疾病特异性生物标志物可视化，其中纳米颗粒被广泛用作造影剂，基于纳米颗粒的细胞摄取，这一新颖的磁共振成像技术可以追踪组织器官内由磁性纳米颗粒标记的细胞在时间和空间上的移动。

Harisinghani等［38］使用低分子量葡聚糖对粒径为2～3nm的超顺磁氧化铁纳米颗粒进行包覆，以形成亲淋巴细胞纳米颗粒，葡聚糖的引入可以明显延长纳米颗粒的循环时间并有效抑制其团聚现象。通过静脉注射使该纳米颗粒进入患者循环系统，利用其作为造影剂，对患者进行MRI诊断。成像结果显示，在恶性肿瘤部分不存在或仅存在少量纳米颗粒，故不显示黑色或仅在边缘部分显示黑色，而在良性肿瘤部位存在大量纳米颗粒，显示较深的黑色，在肿瘤从良性发展为恶性的过程中，其黑色会逐渐变浅。以上结果表明，该方法可以有效区分良性肿瘤和恶性肿瘤，并可根据图像中的颜色深浅对肿瘤的发展阶段加以判断。Zhang等［39］以PVP为稳定剂和修饰剂，通过共沉淀法合成出粒径分别为2nm和7nm的氧化铁纳米颗粒。通过尾静脉注射的方式将该功能化纳米颗粒注入实验小鼠体内，并将实验小鼠置于外加磁场30min后对其进行MRI检测，结果显示，与对照组相比，由于外加磁场的作用，纳米颗粒主要集中于靶向区域，而且注射功能化纳米颗粒的小鼠在肺、肝和肾等部位的阴性对比度明显增强。这表明，该功能化氧化铁纳米颗粒可以在外加磁场作用下定位于特定的靶向组织，并作为MRI诊断的阴性造影剂使用()。

6肿瘤治疗

目前，癌症是世界上主要的致命性疾病之一，而且近年来全球范围内的癌症发病率不断提高，严重威胁着人类的生命安全。根据美国癌症学会的统计数字，2009年全美有近250万新增癌症患者，有超过56万的患者死于各种癌症，相当于每天超过1500名患者死于癌症［40］。目前针对癌症的治疗方法仅限于药物疗法、放射疗法和临床手术疗法，这些常规治疗方法存在着抗癌药物在患者体内的非特异性分布、肿瘤部位有效药物浓度过低、对于治疗效果的监测手段有限以及药物向靶向部位输送效率较差等问题，因而，建立新的癌症治疗手段已经迫在眉睫。由于纳米颗粒具有较小的粒径，使其能够较为顺利的通过癌细胞的细胞膜进入细胞内部，而且其较大的比表面积使其具有较高的活性，因而近年来在癌症治疗领域受到广泛的关注。Yang等［41］以牛血清白蛋白(BSA)为修饰剂，通过溶液合成法，分别合成出粒径为65nm的Ag2S纳米颗粒和直径为40nm、长度为220nm的Ag2S纳米棒，通过氧化铝模板法合成出直径为50nm、长度超过1μm的Ag2S纳米线，红外和染色测试结果显示，BSA被成功包覆于3种Ag2S样品表面。

将上述3种Ag2S纳米样品作用于神经胶质瘤细胞，细胞生物学测试结果表明，与对照组相比，3种样品均能明显抑制肿瘤细胞的增殖，显示出其在治疗肿瘤方面的潜在应用。此外，他们［42］在无外加修饰剂的作用下，通过调控反应条件，利用溶液合成法，分别合成出粒径为50nm的CuS无定形纳米颗粒和粒径为60nm的CuS纳米晶体。将2种样品作用于HL-60白血病细胞、HepG2肝癌细胞及V79-4仓鼠正常细胞并进行相关细胞生物学测试。流式细胞、荧光染色及MTT检测结果显示，与体相晶体相比，2种CuS纳米样品均能显著诱导2种肿瘤细胞发生凋亡，从而显著抑制肿瘤细胞的增殖，而2种样品对正常细胞则均未显示出诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖的作用，这表明2种CuS纳米样品可以通过特异性诱导肿瘤细胞发生凋亡从而抑制其增殖。更为重要的是，统计分析结果显示，2种样品对于肿瘤细胞的诱导凋亡及抑制增殖活性具有显著性差异，CuS无定形纳米颗粒的上述2种活性均明显强于CuS纳米晶体，表明其抗肿瘤活性具有明显的晶型相关性(0)。

7其它应用

除了在上述领域具有广泛的应用外，纳米材料在其它一些领域如组织工程学、细胞及生物分子调控、细胞吞噬动力学研究等方面也受到了越来越广泛的关注。比如，Shen等［43］利用原位沉淀法制备出壳聚糖-聚乳酸/羟基磷灰石复合纳米材料，壳聚糖和聚乳酸的加入可以大幅度提高羟基磷灰石的弹性模量和耐压强度等机械性能，显示其可以作为潜在的骨骼修复材料。

8结语

纳米材料由于其较小的尺寸、较大的比表面积、优异的电学、光学及催化性能、较高的反应活性以及这些性质的可调控性，使其在多个生物学及医学领域，如生物荧光标记、药物和基因传输、病原体和蛋白质等生物分子的检测、DNA结构的研究、组织工程学、肿瘤治疗、细胞和生物分子的分离纯化、磁共振成像(MRI)增强、组织工程学、细胞及生物分子调控等方面，具有广泛的应用前景。将材料技术、生物学及医学相结合，必将使3个学科得到极大发展。利用化学、细胞生物学、分子生物学及医学相关技术，可以使同一纳米颗粒同时具有多种功能，并赋予其良好的生物相容性、生物稳定性及生物分散性，这无疑使纳米颗粒在生物医学领域具有更为广阔的应用前景。然而，由于将纳米颗粒应用于生物医学领域时，一般要通过直接注射的方式使其进入生物体内，因而在临床应用之前，需要深入研究其对于人体健康的影响。目前纳米颗粒对人体健康的影响方面的研究仍相当有限，研究人员必须采取合理的表征方法和研究手段对每一种纳米颗粒的吸附、分布、代谢、排泄、物理化学及毒理学等方面的行为进行体外和体内研究，并将这些研究结果与其生物医学方面的应用相结合，以保证其在人体内的安全性。