胃癌增殖论文：PKGⅡ对胃癌增殖的抑制作用

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本文作者：桑建荣陈永昌李月英陶燕邵根宝作者单位：江苏大学基础医学与医学技术学院生理学系

pkgⅡ对EGF引起的SGC-7901细胞增殖有抑制作用

MTT检测结果显示，Ad-PKGⅡ＋8-pCPT-cGMP＋EGF组细胞的D值明显低于Ad-PKGⅡ＋EGF组和Ad-LacZ＋EGF组（P＜0.01），与Ad-LacZ组比较差异也有统计学意义（P＜0.01）。这说明EGF处理后，明显增强了SGC-7901细胞的增殖能力，用8-pCPT-cGMP作用Ad-PKGⅡ感染的细胞后，细胞的增殖活性明显降低，结果表明PKGⅡ显著抑制了胃癌细胞的增殖（图1）。

PKGⅡ对EGF诱导的p-RSK1的核转录有抑制作用

蛋白质免疫印迹法检测结果显示，8-pCPT-cGMP作用Ad-PKGⅡ感染的SGC-7901细胞后，PKGⅡ显著抑制了EGF引起的RSK1磷酸化水平的升高。同时检测细胞核内p-RSK1（Ser380）的结果表明，PKGⅡ显著抑制了p-RSK1向细胞核内移位（图2A）。免疫荧光检测结果（图2B）显示，EGF处理后，SGC-7901细胞核内有大量p-RSK1（Ser380）的累积；经8-pCPT-cGMP预处理后，EGF诱导的细胞核内p-RSK1（Ser380）的累积大幅度减少，与蛋白质印迹法检测结果一致。

PKGⅡ抑制EGF诱导的SGC-7901细胞中c-Fos和c-JunmRNA及蛋白的表达

RT-PCR检测结果显示，EGF作用SGC-7901细胞后c-Fos和c-JunmRNA的表达水平较Ad-LacZ组明显增加；在Ad-PKGⅡ感染的细胞中加入8-pCPT-cGMP后，c-Fos和c-JunmRNA的表达水平低于Ad-LacZ＋EGF组（图3A）。蛋白质印迹法检测结果显示，EGF可明显上调SGC-7901细胞中c-Fos和c-Jun蛋白的表达；在Ad-PKGⅡ感染的细胞中加入8-pCPT-cGMP后，c-Fos和c-Jun蛋白的表达水平下调（图3B）。

EGF通过与细胞表皮生长因子受体特异性结合，引起靶细胞内一系列生物效应，控制着细胞的增殖、分化和癌变。研究表明，胃癌细胞中EGF及EGFR过度表达，对胃癌的发生和发展有一定作用，而且二者还可刺激某些癌基因的扩增[9,10]。本研究结果显示，Ad-PKGⅡ组对EGF刺激引起的胃癌细胞增殖无明显的影响，但经8-pCPT-cGMP激活PKGⅡ后，即可明显抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖活性。

MAPK介导的信号通路具有调控基因转录、调控细胞周期以及维持细胞生存等生物活性，在肿瘤的发生中有重要的调控作用。EGF及EGFR是MAPK信号转导通路的主要启动者，EGFR磷酸化，活化小G蛋白，进而使丝/苏氨酸激酶Raf和MEK激活，再特异性地激活MAPK中的ERK，最终通过调节多种转录因子[如Elk-1和激活蛋白等]的活性而调控基因表达[11]。本研究结果表明，PKGⅡ对EGF诱导的ERK下游的信号分子RSK和原癌基因的表达均有抑制作用。

哺乳动物中RSK家族已得到证实的有4个成员（RSK1、RSK2、RSK3和RSK4），它们的典型特征是含有2个不同的功能性激酶结构域和羧基端ERKs结合结构域[12,13]。RSK1～3可以被MAPKs磷酸化所激活，也可以通过自身磷酸化激活。RSK在被MAPK磷酸化激活时，由Ras、Raf、MEK和MAPK/ERK信号通路所介导。SK激酶结构域内外的几个位点（包括Ser380、Thr359、Ser363和Thr573）的磷酸化都对RSK激酶活性的激活非常重要。ERK磷酸化RSK1的C-末端激酶结构域Thr573，进而使Ser363和Ser380位点磷酸化，最终完成整个RSK1分子的活化[14,15]。本研究选取受ERK激活通路调节的磷酸化位点Ser380，观察在EGF刺激下，PKGⅡ对胃癌SGC-7901细胞中RSK1活性调节的作用。结果发现，在EGF刺激下，RSK1Ser380位点的磷酸化水平升高，明显高于Ad-LacZ对照组；激活后的PKGⅡ则抑制了p-RSK1（Ser380）和核转录。因此，笔者推测，PKGⅡ是通过ERK依赖的蛋白激酶通路来抑制RSK1的活性，从而抑制胃癌细胞的增殖。当然，为了明确RSK1激活的分子机制，还需要应用ERK通路的抑制剂或激动剂进行进一步的研究。

在肿瘤发生、发展的基因调控中，原癌基因c-Jun和c-Fos尤为重要，易受外界刺激，二者结合组成Ap-1复合体[6]。c-Jun和c-Fos的表达增强并且共同表达，有可能是细胞不断增殖的触发点，它们相互作用并影响其他基因的表达，使细胞最终增殖失控发生癌变[16]。为了进一步研究PKGⅡ对ERK下游信号分子的作用，本研究应用蛋白质印迹法和RT-PCR法对Ap-1的主要组成因子c-Fos和c-Jun进行了蛋白表达及mRNA表达水平的检测，结果表明在感染并激活的PKGⅡ细胞中，c-Jun和c-Fos的表达无论在蛋白水平还是mRNA水平均明显低于Ad-LacZ＋EGF组，提示PKGⅡ可能通过抑制c-Fos和c-JunmRNA及蛋白的表达，进而抑制Ap-1形成。Jun及Fos基因的蛋白表达产物定位于细胞核，目前已知有3种Jun蛋白（c-Jun、JunB和JunD）及4种Fos蛋白（c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2）[17,18]。本研究只检测了PKGⅡ对c-Jun和c-Fos的作用，PKGⅡ对Jun和Fos家族其他成员的蛋白和mRNA的表达是否也有影响，尚有待进一步研究。

研究显示，用编码PKGⅡ的腺病毒感染胃癌细胞，导致PKGⅡ高表达，经8-pCPT-cGMP作用使其激活，可明显抑制EGF诱导的MAPK/ERK激活，使细胞增殖受到明显抑制[7]。结合本研究结果，笔者推测在胃癌发生过程中，PKGⅡ通过抑制ERK，抑制依赖ERK下游的重要激酶RSK1Ser380位点的活化，进而作用于c-Jun和c-Fos，减弱其蛋白的合成以及降低其mRNA的表达，使胃癌细胞的增殖信号转导受到抑制，从而抑制胃癌细胞的增殖。