细胞技术范文精选

一、资料与方法

1、挑选本院2010年6月至2012年12月送检病理科支气管镜刷检细胞学标本252例。所有的患者最后均确诊为肺癌。男184例，女68例，年龄44～85岁，(平均66．3岁)。所有的患者行支气管镜刷检，同时薄层液基细胞学涂片与传统涂片。

2、仪器:美国SurPathTMPrepstain全自动液基薄层细胞制片染片机(BDTriPath，BurlingtonNC，USA)及相关耗材。采用奥林巴斯电子支气管镜(BF-260或1T260工作镜)进行检查。镜下发现肺癌的直接征象或间接征象者，根据胸部CT提示的病变行透视下支气管镜肺活检。所有患者均在活检部位采用南京微创一次性保护型细胞刷刷检，将毛刷头直接在玻片上常规涂片1张。再将毛刷头置于盛有10mlCyteRichRed固定液的50ml离心管中充分震荡漂洗收集细胞。

3、制片方法

3.1传统涂片方法:纤维支气管镜刷头直接涂抹于载玻片上，涂片1张，干燥，95%乙醇固定10min，常规HE染色镜检。

3.2BDTriPath制片方法:标本加入专用50ml离心管中，使用程控离心机以Hettich3#程序600r/min离心10min，迅速管架倒置180°倾出上清液，加入CyteRichRed固定液20ml，静置30min，Hettich的3#程序以600r/min离心10min，迅速管架倒置180°倾出上清液，涡漩混合器振荡均匀，加入10mlTris缓冲液，混均，移至12ml的离心管，Hettich的4#程序以600r/min离心5min，迅速管架倒置180°倾出上清液，涡漩混合器振荡(15±5)s。管架放在PrePStain系统上，静置10min，等待上机自动制片染色。

1PD的环境及职业致病因素

1.1金属元素

有研究发现，某些重金属，比如锰的慢性中毒可损害中枢神经系统，特别是纹状体和苍白球等部位，产生类似PD的锥体外系神经功能障碍。Guilarte等及Huang的研究也发现锰中毒与PD有着密切的联系。Park发现电焊工及其他长期暴露于锰的工人存在着出现神经症状和罹患PD的危险性。Moberly等的研究还表明，锰可以通过作用于嗅球和基底神经节的多巴胺能神经元来影响神经介质的释放，从而导致PD等锥体外系疾病的发生。Coon等利用K-XRF技术测量了慢性暴露条件下铅在人体内的沉积量，并表明长期的铅暴露与PD发病风险成正相关。Komatsu等证实了锰、铁、铅、镉、铝等金属在体内的沉积会导致氧化应激的增加，从而引起PD的发生。

1.2农药百草枯

对多巴胺系统具有神经毒性作用，从而导致PD样症状和改变。Betarbet等利用鱼藤酮复制出了类似PD的大鼠模型，其症状包括出现震颤、步态不稳等。某些PD患者的脑组织中所含有机氯农药，如林丹、狄氏剂的水平明显高于对照组。代森锰（一种杀真菌剂）也被报道与PD的发生相关。还有研究发现，有机磷农药同样与PD的发病相关。

1.3环境毒素

一、材料与方法

1实验对象及样品制备本实验对象为半年内未接受过输血的健康中国人12名，抽取静脉血5ml，使用ABO血型检测试剂检测其ABO血型。其中A型血2人，B型血6人，O型血3人，AB型血1人，RhD血型均为阳性。样品制备人员将A、B、O血型相同且测定的8种血型抗原至少有2种不相同的单一血样制备成体外混合血样。混合血样依据红细胞数按一定比例混合，混合比例分别为95％／5％、97％／3％、98．5％／1．5％、99．5％／0．5％，各比例混合血样的例数分别为8例，8例，8例，10例。样品制备人员将所有单一和混合血样编号后发放给检测人员进行检测分析。

2仪器和试剂本实验所用检测仪器为美国BeckmanCoulter公司生产的FC500型号流式细胞仪。使用抗体为瑞士DiaMed公司生产的单克隆抗体产品，以及SEROTEC公司生产的FITC荧光标记的羊抗人免疫球蛋白。

3实验方法用细胞稳定液将EDTA抗凝的新鲜血稀释后，加入单克隆抗体，使之与相应的红细胞表面抗原结合，并用荧光素标记的示踪抗体标记红细胞表面抗原抗体复合物。使用流式细胞仪对红细胞表面特定血型抗原的表达情况进行数据采集和分析。通过对此方法检测的特异性和灵敏度、信噪比和污染携带率、检测样品稳定性和操作稳定性等方面的检测，验证流式细胞仪检测异体血液回输方法的准确性和可操作性。

二、实验结果

1抗原检测特异性和灵敏度经检测，这46例血样的检测判定结果为：12例单一血样全部被检出单峰并被准确判为阴性。8例95％／5％和8例97％／3％比例混合的血样均被检测出两个以上双峰，所有应为混合双峰的样品均被准确检出；8例98．5％／1．5％比例混合的血样在应出现双峰的样品图中能被识别为双峰，但个别抗体双峰分离效果不佳，需进行抗体优化程序后方能被判定为双峰；10例99．5％／0．5％比例混合的血样中，只有4例样品被判断为含2个以上双峰，其他混合样品由于混合比例低于抗体检测限而无法判定。

1iPSC技术

经典的iPSC技术路线主要包括以下步骤:①选择宿主细胞;②选择外源重组因子;③重组因子导入宿主细胞;④重编程产生iPSC;⑤iPSC的鉴定及分化。

1．1宿主细胞来源Yamanaka将小鼠体细胞诱导为iPSC开启了该技术的先河，之后人、大鼠、猴、猪、绵羊，甚至一些濒危动物的iPSC系纷纷建立。就人类而言，目前已从皮肤成纤维细胞、角质成形细胞、羊水、神经前体细胞、外周血细胞，甚至尿液中获得iPSC。不同组织来源细胞重编程效率及所需因子不同。不仅iPSC分化能力因人而异，在表观遗传稳定性和癌基因的表达方面也存在男女有别现象。使得iPSC技术应用于临床个体治疗更具挑战性。

1．2重组因子的选择及导入方式经典的Yamanaka因子在癌细胞中存在超表达、整合型载体可导致插入突变，且诱导效率非常低。因此，iPSC研究者一直致力于寻求更安全、简单、有效的诱导策略。Anokye-Danso等应用微RNA调控技术，不使用转录因子高效诱导iPSC。Zhou等和Kim等分别利用Yamanaka四因子的融合蛋白和穿膜肽与转录因子蛋白的融合蛋白，直接诱导受体细胞为iPSC，但效率较低。一些学者利用腺病毒、质粒载体瞬时转染靶细胞，或利用Cre/LoxP系统、oriP/EBNAI系统及piggyBac转座系统将外源基因整合后再特异性切除，从而得到不含外源基因整合的iPSC，但是存在基因重排及效率低下现象。而一些小分子化合物(如丙戊酸、曲古抑菌素A、维生素C、筛选激酶抑制剂、BIX-01294、5-AZA、Wnt3a、Zscan4因子)的应用可显著提高iPSC的产生效率。

1．3iPSC的诱导分化Zhao等利用iPSC通过四倍体囊胚注射得到存活并具繁殖能力的小鼠，证明了iPSC的全能性。目前，人们已成功地将iPSC在体外定向诱导分化为神经细胞、造血细胞、胰腺细胞、肝细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、耳蜗毛细胞、色素细胞等类型细胞。

1．4iPSC机制相关研究突破研究人员长期受困于体细胞重编程的具体机制。Polo等绘制出体细胞重编程为iPSC的分子线路图，证实诱导过程引起了两次转录波，分别是由c-myc/Klf4和Oct4/Sox2/Klf4驱动，并确定了重编程过程中路障基因。基于iPSC技术已证明细胞的分化过程并非不可逆转，研究人员利用细胞直接重编程技术将已分化细胞直接转化成特定谱系的细胞，利用间接谱系转化技术部分去分化生成多潜能祖细胞，为干细胞研究开辟了新思路。

1资料与方法

1.1一般资料

患者的入选是根据美国胸科协会制定的诊断指南，存在大于3周以上的咳嗽症状，有至少一条哮喘症状，并且体格检查出现相应体征的儿童患者随机纳入研究，研究时间从2012年1月～2014年6月。

1.2方法采用

流式细胞术。所收集样本冷冻保存，统一检测，末梢血样采集于肝素钠抗凝管中，取100μL血样加入中含有20μL白介素-3的缓冲液中，室温孵育10min，然后加入100μL儿童哮喘患者或健康对照组的血清，室温孵育20min，其中缓冲液包含0.12MNaCI，0.005MKCI，0.025MTris，pH7.6。N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP0.4mmol/L）（Sigma-Aldrich公司，圣路易，MO，USA），一种非特异性细胞活化剂，被用于阳性对照，洗涤缓冲液（0.01M磷酸缓冲盐水包括0.01M的磷酸二氢钠，0.01M磷酸氢二钠，pH为7.2～7.4）被用于阴性对照。孵育结束后将样品置于冷却的冰上防止嗜碱性粒细胞活化和降解，继而与荧光FITC结合的抗CD63抗体孵育BectonDickinson，FranklinLakes，NJ，USA），与荧光PE结合的抗IgE抗体（Pharmacia，Uppsala，Sweden），以及PerCP结合的抗CD45抗体（BectonDickinson）避光孵育20min，加入红细胞溶解液。2500rpm离心10min，将沉淀用缓冲液悬浮，BDFACSCantoⅡ流式细胞仪进行分析。在采集过程中，红色荧光（FL2）和前向散射（FSC）和侧向角散射（SSC）的特点是采用至少1000嗜碱性粒细胞的表达高IgE介导的面密度的选框进行分析，使用FSC/SSC特性淋巴细胞的定义。然后，从这些细胞，FL3/FL2图上嗜碱性粒细胞的认定为CD45低/IgE的高表达。

1.3统计学方法